ECLIA法與RRA法檢測血清促甲狀腺激素受體抗體的對比研究

彭鳴亞 徐龍寶 鄧民斌 薄靜莉 楊其賢

（常州市第二人民醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，江蘇 常州 213003）

Graves?。℅raves disease，GD）是一種器官特異性自身免疫性疾，是在環(huán)境因素與遺傳因素相互作用下，機(jī)體免疫統(tǒng)對自身成分發(fā)生免疫應(yīng)答而導(dǎo)致的疾病狀態(tài)，GD時(shí)體內(nèi)存在多種自身抗體，如促甲狀腺激素受體抗體（TRAb）、甲狀腺球蛋白抗體（TgAb）、甲狀腺過氧化物酶抗體（TPOAb）等，而在GD患者中TRAb的陽性率能達(dá)到95%以上，其在GD發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵的作用，因此準(zhǔn)確檢測患者血清TRAb顯然有助于甲狀腺疾病的鑒別診斷，并對Graves病療效評價(jià)及病程監(jiān)測和預(yù)后有重要的價(jià)值。長期以來，臨床上血清TRAb的檢測基本采用放射受體分析方法（RRA）或ELISA這兩種手工檢測方法，雖然這兩種方法具有結(jié)果較精確，經(jīng)濟(jì)成本低等優(yōu)點(diǎn)，但也存在檢測耗時(shí)較長，操作過程不可控因素相對比較多，檢測的質(zhì)量控制相對不穩(wěn)定，對操作者技術(shù)要求較高等制約因素。近來，羅氏診斷公司已采用全自動電化學(xué)發(fā)光免疫方法（ECLIA）檢測TRAb，其顯著的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便、快捷。國際多中心研究報(bào)告提示該方法也有較高的診斷靈敏度和特異性[1]。本文擬將ECLIA與天津協(xié)和醫(yī)藥科技有限公司提供的RRA試劑進(jìn)行對比分析，以驗(yàn)證ECLIA法檢測TRAb的可行性和臨床實(shí)用性。

1 對象與方法

1.1 對象

正常對照組158例，其中男51例，女107例。年齡范圍18～83歲，均為健康體檢者，無甲狀腺疾病史，實(shí)驗(yàn)室甲狀腺功能檢查均正常。Graves病組159例，其中男49例，女110例，年齡范圍16～82歲，均為門診初診患者，實(shí)驗(yàn)室甲狀腺功能檢查均異常。

1.2 方法

ECLIA采用Roche Cobas600全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)及配套試劑（羅氏診斷公司，德國）。檢測原理為：通過一種生物素標(biāo)記的抗豬促甲狀腺激素受體（TSHR）小鼠單克隆捕獲抗體，將可溶豬TSHR固定于鏈霉親和素包被的微粒上，捕獲抗體結(jié)合于豬TSHR的C末端，不會干擾TRAb或人TSHR刺激單克隆抗體（M22）與TSHR的結(jié)合，通過檢測TRAb抑制釕標(biāo)記M22結(jié)合TSHR的能力進(jìn)行測定。實(shí)驗(yàn)所需的樣本容量為50μL，總體實(shí)驗(yàn)時(shí)間27min。測定范圍0.3～40IU/L。

RRA方法檢測采用天津協(xié)和醫(yī)藥科技有限公司提供的RRA試劑盒，檢測原理為：由于TRAb能阻礙TSH與TSH受體的結(jié)合，因此將TSH受體與血清125I-TSH標(biāo)記物一起溫育，TRAb與標(biāo)記物競爭結(jié)合受體的部位，因此若TRAb滴定度較高，則125I-TSH結(jié)合受體就較低。溫育后加入沉淀劑使受體-標(biāo)記物復(fù)合物沉淀，離心后棄上清，測量沉淀物的放射性強(qiáng)度從而得出TRAb的值。實(shí)驗(yàn)所需的樣本容量為50μL，總體實(shí)驗(yàn)時(shí)間3h。測定范圍0.5～40.5IU/L。

所有受檢者均以血清管采清晨空腹靜脈血3mL，待血液凝固后分離血清，2～8℃保存，并于48h內(nèi)采用ECLIA和RRA兩種方法檢測TRAb，同一份血清分別采用雙管檢測后取其平均值作為檢測值。

取低濃度與高濃度TRAb血清樣本，分別以ECLIA和RRA方法重復(fù)測定10次，計(jì)算各自測量值、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSSl3.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)算正常人群的第97.5百分位數(shù)（P97.5）作為TRAb正常參考值的上限，根據(jù)該值對樣本進(jìn)行陰陽性分類，差異性比較采用McNemar檢驗(yàn)，兩種檢測方法所得結(jié)果之間采用Wilcoxon配對比較，相關(guān)分析采用Spearman秩相關(guān)。

2 結(jié) 果

2.1 診斷符合率

取正常對照組者檢測結(jié)果的P97.5作為TRAb正常參考值的上限，ECLIA法與RRA法分別為1.37IU/L與2.01IU/L，以此對159對甲狀腺功能亢進(jìn)患者的檢測結(jié)果進(jìn)行陰陽差異性分類，結(jié)果見表1，兩種檢測方法均呈陽性為127例，（占ECLIA總陽性的94.8%）均呈陰性為20例（占ECLIA總陰性的80.0%），ECLIA陽性而RRA陰性7例，ECLIA陰性而RRA陽性5例，總診斷符合率86%，McNema分類差異P=0.896，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分類一致性Kappa值為0.845（P＜0.01）。結(jié)果說明兩種檢測方法的檢測結(jié)果對臨床判斷雖有差異，但整體判斷較一致，影響不大。

表1 兩種方法檢測結(jié)果

2.2 兩種方法檢測TRAb值的相關(guān)性

兩種檢測方法對所有實(shí)驗(yàn)血清樣品TRAb對比檢測結(jié)果顯示：Roche ECLIA的TRAb檢測數(shù)值明顯低于RRA檢測值，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后得出兩種方法Wilcoxon配對檢驗(yàn)Z值為－9.258（P＜0.01），提示兩種方法的檢測值之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但兩種方法得出的檢測值的Spearman相關(guān)系數(shù)為0.792（P＜0.01），提示兩種TRAb檢測方法的整體相關(guān)性良好。

2.3 精密度

選取TRAb低濃度血清（ECLIA法檢測值為1.98IU/L，RRA法檢測值為2.45IU/L）與TRAb高濃度（ECLIA法檢測值為29.8IU/L，RRA法檢測值為31.2IU/L）重復(fù)測量10次，計(jì)算各自的變異系數(shù)，ECLIA法：低濃度TRAb的變異系數(shù)：3.7%，高濃度TRAb的變異系數(shù)：1.2%。RRA法：低濃度TRAb的變異系數(shù)：12.7%，高濃度TRAb的變異系數(shù)：7.4%。ECLIA法檢測TRAb的穩(wěn)定性較RRA法明顯好，且兩種方法在檢測血清高濃度TRAb的穩(wěn)定性均較檢測血清低濃度TRAb好。

3 討 論

血清TRAb的濃度，對GD引起甲狀腺外表現(xiàn)和其他甲狀腺疾病的診斷、評估療效、確定停藥時(shí)機(jī)、預(yù)測復(fù)發(fā)及鑒別高危人群等方面又中藥的臨床意義，因此，TRAb的檢測方法直接影響著臨床對甲狀腺疾病的判斷、治療等，目前TRAb的檢測方法主要有兩類，即受體分析法及生物分析法[2]。臨床上應(yīng)用較廣的是RRA法和ELISA法，而這兩種方法均存在檢測速度慢，人為影響因素多等實(shí)際問題，羅氏公司基于生物分析法的原理，將TRAb納入ECLIA系統(tǒng)，去除了人為影響因素，并縮短了檢測時(shí)間，提高了檢測效率。

本研究結(jié)果顯示：RRA法與ECLIA法在檢測同一份血清TRAb時(shí)，檢測值有明顯的差異，產(chǎn)生這種差異性的原因很多，考慮以下因素最有可能：TRAb本身屬于多克隆混合抗體性質(zhì)，兩種方法所選擇的TSHR來源不同，免疫結(jié)合在識別位點(diǎn)上不同，由此造成檢測結(jié)果形成差異，因此，在使用不同方法檢測血清TRAb時(shí)，有必要確定不同方法的正常參考值，否則，則有可能對患者個(gè)體檢測結(jié)果產(chǎn)生顯著影響，這一點(diǎn)應(yīng)引起實(shí)驗(yàn)室和臨床醫(yī)師的重視。當(dāng)臨床判斷預(yù)期與實(shí)驗(yàn)室TRAb分析結(jié)果相矛盾時(shí)，除進(jìn)行必要的誤差分析外，尚需注意其正常參考值的設(shè)定是否正確。

由于加樣準(zhǔn)確、檢測條件穩(wěn)定等多種因素，自動化檢測的優(yōu)勢之一在于免疫檢測的精密度和穩(wěn)定性比手工方法好[3]，本研究的結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。在進(jìn)行的簡化批內(nèi)誤差分析實(shí)驗(yàn)中，我們注意到無論是低值還是高值，ECLIA批內(nèi)變異系數(shù)均較RRA法小，顯示出ECLIA法在精密度和穩(wěn)定性方面的優(yōu)異表現(xiàn)。

由于實(shí)驗(yàn)條件限制，本研究局限性在于尚沒有對ECLIA檢測TRAb進(jìn)行系統(tǒng)性的回收率測定，由于ECLIA和RRA方法對TRAb的有效檢測量程均有限（分別為＜40IU/L及＜40.5IU/L），因此臨床上經(jīng)常出現(xiàn)患者TRAb血清濃度高出測量上限（本研究中包含13個(gè)病例），因此，在遇到這種情況時(shí)，需要對樣品進(jìn)行稀釋后進(jìn)行檢測，而免疫檢測中高濃度樣品的稀釋往往不成線性，因此常無法判斷GD病的危險(xiǎn)度和對治療效果進(jìn)行監(jiān)測，因此，若能進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)ECLIA法的回收率較高，則能進(jìn)一步顯示ECLIA法的優(yōu)勢。

由于時(shí)間限制，本研究的其他局限性還包括在標(biāo)本的收集方面不太完善，未能獲得甲狀腺功能亢進(jìn)患者全面的診斷和治療隨訪的全面信息，同時(shí)對于臨床判斷的正常參考值僅限于為本研究的表面健康人群，未經(jīng)過大樣本的臨床研究得到最終確定。至于血清內(nèi)其他成分如甲狀腺球蛋白抗體（TGAb）和甲狀腺過氧化物酶抗體（TPOAb）等因素對TRAb檢測值的影響也需要實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證。

無論如何，采用ECLIA檢測TRAb的方法學(xué)優(yōu)勢顯著。該方法檢測速度快，整個(gè)檢測過程不超過30min，能使患者和臨床醫(yī)生快速取得檢測結(jié)果，為臨床治療提供即刻信息。臨床實(shí)驗(yàn)室采用免疫自動化方法檢測TRAb將成為一種趨勢[4]。

[1] Sehott M,Hermsen D,Broecker-Preuss M,et a1.Clinical value of the first at Jtol/I,tlted TSH receptor a atoantibody assay for the diagnosis of Groves’ disease(GD):an international muhieentre tRRAl[J].Clin Endocrinol,2009,71(8):566-573.

[2] 周亞芹,蘇青.促甲狀腺素受體抗體的檢測方法[J].放射免疫學(xué)雜志,2009,22(1):40-43.

[3] Yoshimura NJ,Miyazaki N,Ito K,et a1.Evaluation of a new rapidand fully automated electrochemiluminescence immunoassay for thyrotropin receptor autoantibedies[J].Thyroid,2009,18(10):1157-1164.

[4] Hermsen D,Broecker-Preuss M,Casati M,et a1.Technical evaluation of the firstfully automated assay for the detection of TSH receptor autoantibodies[J].Clinica Chemiea Acts,2009,40(1/2):84-89.