大鼠實(shí)驗(yàn)性腦外傷后核因子κB活化與細(xì)胞凋亡的關(guān)系研究

孫江紅 郭相杰

（1 山西省高級(jí)人民法院證據(jù)技術(shù)中心，山西 太原 030024；2 山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院病理教研室，山西 太原 030001）

腦外傷（traumatic brain injury，TBI）是法醫(yī)實(shí)踐中最常見的暴力死亡因素，腦外傷會(huì)引起一系列的病理、生理、生化方面的改變，如蛛網(wǎng)膜下腔出血、顱內(nèi)血腫、腦水腫、腦循環(huán)障礙等，造成腦的二次損傷和多次損傷。腦外傷的發(fā)生發(fā)展、損傷形成的機(jī)制、損傷程度的分析以及預(yù)后判斷一直受到法醫(yī)工作者的重視，其中損傷程度的判定成為判定案件性質(zhì)及量刑的主要依據(jù)[1,2]。

目前對(duì)腦外傷細(xì)胞水平的研究多集中在腦外傷后神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡。近年來一系列尸檢腦組織標(biāo)本及的腦外傷動(dòng)物模型研究證實(shí)，TBI后細(xì)胞凋亡參與了繼發(fā)性腦損傷的發(fā)展過程，細(xì)胞凋亡與腦外傷密切相關(guān)。許多研究表明，繼發(fā)性神經(jīng)元死亡有10%～50%是神經(jīng)元凋亡引起的。神經(jīng)元凋亡生在創(chuàng)傷灶的中心部位外，主要出現(xiàn)在傷灶4周的缺血、缺氧區(qū)，即所謂遲發(fā)性神經(jīng)元死亡[2-5]。

腦外傷后還涉及一系列細(xì)胞因子的變化，包括腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、核因子κB （neucler factorκB，NF-κB）、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）等，這些細(xì)胞因子的相互作用在很大程度上決定了損傷的發(fā)展及嚴(yán)重程度。NF-κB是近年發(fā)現(xiàn)的最重要的轉(zhuǎn)錄因子之一，正常情況下胞漿內(nèi)與抑制蛋白（IκB）結(jié)合而呈非活性狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到各種刺激原如紫外輻射、細(xì)胞因子（如TNF-α、IL-1）、損傷時(shí)，NF-κB與IκB解離并進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與特定的啟動(dòng)子結(jié)合，從而調(diào)控各種基因的表達(dá)，如細(xì)胞因子、炎性因子、黏附分子等。NF-κB在炎癥發(fā)生時(shí)復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中起著中心調(diào)節(jié)作用。腦外傷后NF-κB的激活及其調(diào)節(jié)，正是近年來的研究熱點(diǎn)之一[6-8]。

由此可見，腦外傷后細(xì)胞凋亡的發(fā)生及NF-κB活化是決定腦外傷損傷程度的兩個(gè)重要因素。本研究以實(shí)驗(yàn)性腦外傷大鼠為模型，對(duì)外傷后不同時(shí)間的凋亡發(fā)生及NF-κB的活化進(jìn)行檢測(cè)，考察二者的關(guān)系，同時(shí)對(duì)NF-κB活化進(jìn)行干預(yù)，以明確NF-κB與凋亡發(fā)生的關(guān)系，從而對(duì)腦損傷程度的鑒定提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

將72只Wistar大鼠隨機(jī)分成24個(gè)小組，每組3只，其中8組作為對(duì)照組8組，8組作為實(shí)驗(yàn)組，8組作為PDTC（Pyrrolidine dithocarbamate）組，PDTC（Sigma）預(yù)先按100mg/kg體質(zhì)量腹腔注射。實(shí)驗(yàn)組及PDTC組大鼠制造腦外傷模型[2]。對(duì)照組制造假損傷，僅切開頭皮、右頂部開骨窗，不致腦外傷。

各組動(dòng)物分別在腦外傷后0h、1h、6h、12h、24h、48h、72h、168h斷頭，取出整腦，沿挫傷灶中央作冠狀切面取材（包括未損傷的左側(cè)腦組織），前半部分腦組織用液氮冷凍后放人-70℃冰箱保存?zhèn)溆?，后半部分腦組織固定于4%多聚甲醛0.1mol/L PBS溶液中24h，用石蠟包埋。

1.2 方法

1.2.1 TUNEL 鑒定細(xì)胞凋亡

應(yīng)用TUNEL試劑盒（Roche）原位標(biāo)記凋亡細(xì)胞，按說明書操作，對(duì)以挫傷灶為中心60°腦域內(nèi)TUNEL陽性細(xì)胞進(jìn)行圖像分析，以計(jì)算凋亡細(xì)胞的比例。

1.2.2 凝膠電泳遷移率變遷分析（Electrophoretic mobility shift assay，EMSA）鑒定NF-κB的活化

收集腦組織，抽提核蛋白，按說明書加入20～50 fmol的32P 標(biāo)記（30000～50000cpm）的NF-κB特異寡核苷酸探針（5AGTTGAGGGGA CTTTCCCAGGC3），混勻后室溫下孵育10min，SDS PAGE電泳，電泳畢凝膠轉(zhuǎn)移至濾紙上，覆X線片暗房中曝光72h，顯影后作圖像分析。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（χ—±s）表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)和單因素方差分析，取P＜0.05表示統(tǒng)計(jì)結(jié)果具有顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 腦外傷引起細(xì)胞凋亡

結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組在腦外傷24h后損傷腦域內(nèi)出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡，到48h到達(dá)峰值，然后逐漸回落，與對(duì)照組相比，24h、48h、72h、168h均有顯著差異（P＜0.05）；對(duì)照組一直未出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡（圖1）。

圖1 大鼠實(shí)驗(yàn)性腦外傷后不同時(shí)間神經(jīng)凋亡細(xì)胞的比例 （±s， n=3）

2.2 腦外傷引起NF-κB的活化

結(jié)果顯示，創(chuàng)傷組在腦外傷1h后NF-κB開始活化，到24h到達(dá)峰值，然后逐漸回落；同時(shí)，對(duì)照組NF-κB活性也出現(xiàn)了升高-降低的動(dòng)態(tài)變化，但幅度較小。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照相比，1h、6h、12h、24h、48h、72h均有顯著差異（P＜0.05）（圖2）。

圖2 大鼠實(shí)驗(yàn)性腦外傷后不同時(shí)間NF-κB的活性 （±s，n=3）A：EMSA顯示24h NF-κB活化情況；B：直方圖

2.3 PDTC 可加劇腦外傷引起的細(xì)胞凋亡

PDTC是NF-κB特異抑制劑，結(jié)果顯示，在PDTC應(yīng)用組，凋亡細(xì)胞比例明顯增加，PDTC組與未加PDTC組相比，24h、48h、72h、168h均有顯著差異（P＜0.05）；同時(shí)，PDTC組凋亡的發(fā)生亦隨時(shí)間發(fā)生了“升高-降低”的變化

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，在急性腦外傷后，大鼠受傷腦域內(nèi)隨時(shí)間出現(xiàn)了大量的凋亡細(xì)胞，但隨著時(shí)間進(jìn)一步發(fā)展，凋亡細(xì)胞比例又逐漸下降，造成這一現(xiàn)象的原因可能是多方面的，比如有一部分凋亡細(xì)胞最終壞死崩解，或者一部分早期的凋亡細(xì)胞其凋亡被逆轉(zhuǎn)。這些結(jié)果提示我們，凋亡可以作為腦損傷程度判定的一個(gè)因素。在法醫(yī)實(shí)踐中，可以運(yùn)用TUNEL法對(duì)尸檢腦組織鑒定凋亡細(xì)胞的比例，從而增加腦損傷判定以及損傷時(shí)間推測(cè)的依據(jù)，目前實(shí)際上已經(jīng)開展了這方面的工作[9]。

本研究還顯示，NF-κB的活化出現(xiàn)在腦損傷的早期，并且NF-κB特異抑制劑PDTC可以增加凋亡細(xì)胞的比例，說明在腦損傷過程中，NF-κB具有保護(hù)細(xì)胞免于凋亡的功能。綜合考慮NF-κB活化程度與細(xì)胞凋亡的比例，可為判斷腦損傷時(shí)間提供很多有益的信息。但同時(shí)其他研究顯示，在腦損傷所致的腦水腫、炎癥過程中，NF-κB起到關(guān)鍵的促進(jìn)作用[10]，因此可以說在腦外傷后，NF-κB的活化是一把“雙刃劍”。這就提示我們，在法醫(yī)實(shí)踐中，應(yīng)慎重對(duì)待NF-κB活化這一指標(biāo)，應(yīng)進(jìn)一步對(duì)NF-κB所調(diào)控的細(xì)胞因子進(jìn)行鑒定，才能夠全面地判定腦損傷的程度和時(shí)間。

圖3 PDTC可增加腦外傷后的細(xì)胞凋亡（±s, n=3）

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