大鼠核轉錄因子Atoh1的克隆表達及鑒定

鄭國璽 ?？?侯瑾 朱珠 韋俊榮 許珉

·實驗研究·

大鼠核轉錄因子Atoh1的克隆表達及鑒定

鄭國璽1?？?侯瑾1朱珠1韋俊榮1許珉1

目的 利用基因工程方法克隆SD大鼠Atoh1基因CDS區(qū)序列，構建大鼠核轉錄因子Atoh1的真核表達載體并在真核細胞中表達。方法 從兩只SD大鼠結腸黏膜提取總RNA，采用逆轉錄PCR法擴增Atoh1基因CDS區(qū)序列并亞克隆于PMD－19T載體中。測序鑒定后將Atoh1基因連接于含有EGFP和內部核糖體轉入位點（IRES）的真核細胞表達載體pIRES2－EGFP中，對重組質粒進行酶切鑒定和測序鑒定后，以脂質體介導法轉染至293T細胞，熒光顯微鏡和Western blot檢測其在293T細胞中的表達。結果 擴增得到大鼠Atoh1 CDS區(qū)長1 056 bp，編碼351個氨基酸，與GeneBank公布的參考序列對比，有兩處堿基發(fā)生突變，但克隆序列編碼的氨基酸序列與參考序列完全一致，兩處堿基應為單核苷酸多態(tài)性（SNP），突變?yōu)闊o義突變，不影響蛋白表達。雙酶切和測序結果證明Atoh1已正確地克隆到真核表達載體pIRES2－EGFP中，熒光顯微鏡和Western blot證實Atoh1目的蛋白能在293T細胞中穩(wěn)定表達。結論 基因工程方法可成功克隆出Atoh1編碼序列，真核表達載體p Atoh1－IRES2－EGFP構建成功并可以在293T細胞中表達。

感音神經性聾； Atoh1； 基因； 克??； 真核表達載體

大多數(shù)感音神經性聾是由毛細胞和與之相聯(lián)系的螺旋神經損傷和退化所造成，目前尚無確切有效的治療方法。長期以來人們在探討毛細胞分化和再生的機制方面做出了不懈的努力，刺激毛細胞的再生從而修復受損聽覺和平衡覺已成為當今研究的重點。研究已證實堿性螺旋－環(huán)－螺旋（basic helixloop－h(huán)elix，b HLH）轉錄因子家族是一類重要的神經發(fā)育調節(jié)因子，在神經系統(tǒng)發(fā)育的多個部位、不同時期發(fā)揮神經決定作用。Atoh1基因是b HLH轉錄因子家族中的一員，是本體感受系統(tǒng)（包括內耳毛細胞，小腦顆粒神經元和橋腦核）發(fā)育所必需的因子，調控著復雜的本體感受通路［1］，其在耳蝸發(fā)育中的功能是啟動調節(jié)整個感覺上皮形成的誘導和移植信號系統(tǒng)［2］。Atoh1作為正性調控基因，也是哺乳類動物內耳毛細胞形態(tài)和功能再生過程中必不可少的基因，故其在內耳感覺細胞分化過程中的重要調節(jié)作用越來越受到研究者的重視。本實驗擬通過克隆Atoh1 cDNA編碼序列和構建真核表達載體p A-toh1－IRES2－EGFP，進一步探索Atoh1的表達、生物學活性及作用機制，為感音神經性聾的基因治療奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒及主要試劑 大腸桿菌TOP10購于華美生物工程公司；p MD－19T Vector和pIRES2－EGFP真核表達載體購自Invitrogen公司；限制性內切酶SalⅠ、Bam HⅠ、XbaⅠ、T4連接酶及DNA聚合酶購于Ta KaRa公司；質粒小抽試劑盒、PCR反應試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、Trizol total RNA試劑盒等分別購于Axrgen公司和TOYOBO公司；兔抗鼠Atoh1多抗購自美國A-beam公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗購自武漢博士德公司。主要試劑為國產或進口分析純。

1.2 細胞培養(yǎng)與實驗動物 293T細胞（購自中國科學院典藏細胞委員會細胞庫）用含10%的小牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。實驗動物為健康SD大鼠乳鼠兩只，鼠齡兩天，體重10～20 g，由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。

1.3 方法

1.3.1 SD大鼠總RNA的提取 參照Trizol totalRNA試劑盒說明書，采用一步法提取SD大鼠結腸組織中的總RNA。從SD大鼠乳鼠切取100 mg新鮮結腸組織，PBS洗滌后加入1 ml Trizol RNA提取液，冰浴中研磨混勻，直至勻漿液呈無顆粒透明狀。將裂解液轉移至離心管中，在室溫下放置5 min，使得核酸蛋白復合物完全分離。4℃12 000 rpm離心15 min。取上清液加入200μl氯仿，混勻后室溫靜置15 min，4℃12 000 rpm離心15 min。吸取上清移至新的1.5 ml ep管，加入等體積－20℃預冷的異丙醇，混勻后－20℃沉淀10 min。4℃12 000 rpm離心10 min后，去上清，加入1 ml 4℃預冷的75%乙醇洗滌沉淀，渦旋混勻，4℃10 000 rpm離心5 min，棄上清。吸水紙吸去殘液，室溫干燥。將沉淀溶于20μl RNase－free水，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 Atoh1基因CDS區(qū)序列的擴增 根據(jù)Gen Bank提供的已知序列（GeneID：NM＿001109238.1）應用DNAsis軟件設計Atoh1基因CDS區(qū)序列引物。上游引物：5＇－ATGTCCCGCCTGCTGC－3＇，下游引物：5＇－CTAACTGGCCTCGTCAGAGTC－3＇。用Mo－MLV逆轉錄酶將提取的SD大鼠結腸總RNA反轉錄成cDNA。在PCR擴增儀上以Atohl基因cDNA為模板，進行Atoh1基因CDS擴增。PCR擴增體系：10× Buffer 5μl，MgSO4（50 m M）2μl，d NTP（10 m M）1μl，Taq HiFi（5 U／μl，Invitrogen）0.2μl，Primer F（10 u M）1μl，Primer R（10 u M）1μl，cDNA 1μl，加dd H2O至50μl。反應循環(huán)條件為：94℃預變性3 min，94℃30 s、58℃30 s、68℃1 min，35個循環(huán)，最后68℃延伸10 min。PCR產物進行10 g／L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.3.3 目的片段的亞克隆及鑒定 T4 DNA連接酶連接回收的PCR產物至p MD19－T vector。連接體系為10×T4連接酶Buffer 1μl，PCR產物2 μl，p MD19－T vector載體1μl，T4連接酶1μl，補dd H20至10μl，16℃連接過夜。將5μl連接產物轉化至自制TOP10感受態(tài)細胞，37℃250 rpm／min振蕩培養(yǎng)45 min，使細菌復蘇。取200μl轉化后的TOP10菌液，涂布于含100μl氨芐霉素（100 mg／m1）和X－gal抗性的LB平皿中，37℃倒置培養(yǎng)過夜，至克隆長出。藍白篩選挑取白色單菌落進行菌落PCR，PCR鑒定呈陽性者克隆在LB液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)過夜，質粒DNA小量提取法抽提質粒。分別用限制性內切酶XbaⅠ及Sal I對重組質粒進行雙酶切。10 g／L瓊脂糖凝膠電泳進行分析鑒定。將菌落PCR和酶切鑒定均呈陽性的克隆送測序，并進行序列比對。

1.3.4 Atoh1基因p IRES2－EGFP表達載體構建及鑒定 重組質粒構建策略與步驟見圖1。取5μl連接液轉化TOP10感受態(tài)細胞，37℃250 rpm／min振蕩培養(yǎng)45 min，使細菌復蘇。離心收集菌液，涂布于含卡那霉素（100 mg／ml）的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，至克隆長出。挑取白色單菌落進行菌落PCR，將PCR鑒定呈陽性的克隆在含卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，搖菌過夜，次日抽提質粒進行酶切鑒定，將菌落PCR和酶切鑒定均呈陽性的克隆送測序，并進行序列比對。

圖1 重組真核表達載體p Atoh1－IRES2－EGFP構建示意圖

1.3.5 重組質粒pIRES2－EGFP－Atoh1轉染293T細胞 用含有100 ml／L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)293T細胞，轉染前24 h傳代，接種入24孔板中，每孔2×105個細胞。依照LipofectamineTM2000轉染試劑盒操作說明進行轉染，取重組質粒p Atoh1－IRES2－EGFP和空質粒0.8μg各用50μl無血清培養(yǎng)基稀釋并混勻，室溫下靜置孵育5 min。同時，用50μl無血清培養(yǎng)基分別稀釋2μl LipofectamineTM2 000并混勻，室溫下靜置孵育5 min。將兩種試劑分別充分混勻，形成不同的轉染復合物，室溫靜置20 min。用400μl完全培養(yǎng)基更換原先的培養(yǎng)基后，將DNA／LipofectamineTM2 000混合物加入24孔板，輕輕混勻，置于二氧化碳（體積分數(shù)5%，37℃）培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，熒光顯微鏡下觀察轉染效率。

1.3.6 細胞毒性測定 將293T細胞以1×105／孔接種于96孔板，按上述方法及濃度細胞轉染，每孔加入100μl轉染試劑，設5個復孔，同時設置5個調零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜）和5個對照孔（293T細胞、轉染試劑、培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），5%CO237℃孵育24 h，每孔加入20μl MTT溶液（5 mg／ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去孔內培養(yǎng)液，每孔加入150μl二甲基亞砜，至搖床上低速振蕩10 min，使結晶充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD 490 nm處測量各孔的吸光值，細胞存活率（%）＝實驗組光吸收值／對照組光吸收值× 100%。

1.3.7 免疫印跡 轉染48 h后，收集細胞.用預冷的PBS洗滌2次，加入400μl細胞裂解液混勻，4℃振蕩裂解30 min。細胞裂解物在4℃下12 000 rpm離心20 min。收獲上清為樣本，經考馬斯亮蘭法測定蛋白濃度。將各樣本等量的蛋白與2×上樣緩沖液混勻，待煮沸10 min后置于冰浴中作為電泳樣品。同時配制15%聚丙烯酰胺分離膠以等電壓100 V電泳，待溴酚藍達底部邊緣后停止，再按100 V電壓于90 min內轉膜，并將聚偏氟乙烯膜在含0.05%吐溫－20的Tris－HCl緩沖液（TBST）中短暫漂洗后置于5%脫脂奶粉TBST封閉液中，于室溫內孵育2 h后將膜置入兔抗鼠Atoh1多抗／兔抗鼠β－actin（稀釋濃度為1：1000，兔抗鼠β－actin抗體，稀釋濃度為1：800）中，于4℃內冰箱過夜；待TBST洗膜10 min×3次后將膜放入第二抗體（辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗，稀釋度為l：2 000）中，予室溫反應lh，經TBST洗膜10 min×4次。最后以增強化學發(fā)光法顯色，于暗盒中X線曝光2 s至2 min；采用圖像分析軟件ImageJ測條帶灰度值，并轉換成光密度值作為Atoh1蛋白的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學方法 用SPSS V13統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，多組間比較采用單因素方差分析（one－way ANOVA）。

2 結果

2.1 Atoh1基因全長的擴增 電泳圖（圖2）中可見PCR擴增的1 056 bp大小的目的片段（泳道2），并且與陽性對照Atoh1 cDNA模板（泳道1）條帶一致。初步判定PCR擴增出Atoh1全長基因。

圖2 Atoh1基因PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳鑒定1：Atoh1 cDNA；2：PCR產物；3：Marker DL5000

2.2 重組質粒p MD－19T／Atoh1的構建及鑒定轉化后的TOP10感受態(tài)細菌，經過夜培養(yǎng)，獲得白色菌落數(shù)30～40個／皿，初步表明重組質粒p MD－19T／Atoh1構建成功。酶切鑒定結果（圖3）：凝膠電泳結果顯示1 056 bp大小的目的條帶和2 692 bp大小的p MD－19T載體片段。說明Atoh1已經重組于p MD－19T vertor內。

圖3 重組質粒p MD－19T／Atoh1酶切鑒定1：Marker DL5000；2：XbaⅠand SalⅠ雙酶切p MD－19 T／Atoh1；3：XbaⅠand SalⅠ雙酶切p MD－19T

2.3 目的片段TA克隆測序結果 測序結果顯示插入基因片段為1 056 bp，編碼351個氨基酸。用NCBI／BLAST軟件測序結果與GeneBank公布參考序列序列對比分析，在第606位和720位堿基上有兩處突變：606堿基處G突變?yōu)锳，720堿基處T突變?yōu)镃。用DNAstar軟件對克隆序列所編碼的氨基酸序列進行分析，克隆序列長1 056 bp，編碼351個氨基酸，與參考序列編碼的氨基酸序列一致，兩者同源性99%，相似性100%，無讀碼框移。說明兩處突變?yōu)闊o義突變，606 bp與720 bp可能為單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點，所致的編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質的氨基酸序列，也不影響蛋白的表達。

2.4 Atoh1基因pIRES2－EGFP表達載體構建及鑒定 電泳結果（圖4）1 056 bp大小的目的片段和5.3 kb大小的pIRES2－EGFP質粒片段經XbaⅠ酶切，可將質粒線性化，因為XbaI是T載體上SalⅠ和Bam HⅠ之間的酶切位點，在回收目的片段時保留在目的基因末端，而質粒p IRES2－EGFP中沒有XbaⅠ酶切位點，電泳結果說明Atoh1已經重組于p IRES2－EGFP質粒中。

圖4 p Atoh1－IRES2－EGFP重組質粒酶切鑒定1：Atoh1 cDNA；2：Marker DL2000；3：重組質粒p Atoh1－IRES2－EGFP；4：SalⅠand Bam HⅠ雙酶切重組質粒p Atoh1－IRES2－EGFP；5：Marker DL5000；6：XbaⅠ單酶切重組質粒p A-toh1－IRES2－EGFP

2.5 重組真核質粒測序結果 測序結果顯示重組真核質粒構建成功，其目的基因插入方向和序列完全正確，編碼氨基酸序列與NCBI公布的參考序列一致，無讀碼框移。

2.6 熒光鏡檢p Atoh1－IRES2－EGFP質粒在293T細胞中的表達 在轉染重組質粒p Atoh1－IRES2－EGFP的293T細胞內可見綠色熒光表達（圖5）。計算熒光顯微鏡下綠色成像細胞數(shù)量與普通顯微鏡下的細胞數(shù)量，可得知轉染效率約為70%.提示重組質粒p Atoh1－IRES2－EGFP在真核細胞內能顯著表達。

圖5 重組真核質粒p Atoh1－IRES2－EGFP轉染293 T細胞48h后綠色熒光表達a為光學顯微鏡下48小時后觀察未轉染組293 T細胞形態(tài)（×200）；b為轉染空質粒pIRES2－EGFP；c轉染重組質粒p Atoh1－IRES2－EGFP；b、c為轉染48小時后在熒光顯微鏡下觀察（×200）

2.7 p Atoh1－IRES2－EGFP質粒對293T細胞的毒性作用 未轉染空白對照組細胞生存率為100%，轉染空質粒和p Atoh1－IRES2－EGFP的細胞生存率分別為82.6%和78.5%。轉染空質粒與質粒p Atoh1－IRES2－EGFP后分別與未轉染組對比，細胞存活率差異無顯著統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明帶Atoh1基因質粒的轉染對293T細胞的存活無影響。

2.8 免疫印跡 Westem blot結果檢測到轉染重組質粒組Atoh1蛋白的表達（圖6），說明構建的真核質粒可以在真核細胞內正確表達Atoh1基因，同時再次證實兩處突變并不影響蛋白的表達。以目的條帶與內參條帶光密度值計算結果，轉染重組質粒pAtoh1－IRES2－EGFP細胞組、轉染空質粒組和對照組測定值分別為108.0±2.1、46.3±2.6、38.2±3.0。經方差分析顯示，轉染重組質粒組的Atoh1表達水平較對照組和轉染空質粒組顯著增高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），而轉染空載質粒組與對照組的Atoh1表達水平的差異則無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖6 轉染p Atoh1－IRES2－EGFP質粒后293T細胞中Atoh1蛋白的westem blot鑒定1：對照組；2：轉染重組質粒pAtoh1－IRES2－EGFP；3：轉染空質粒pIRES2－EGFP.

3 討論

感音神經性聾因其致病因素和臨床表現(xiàn)形式呈現(xiàn)的多樣性，使該類疾病目前尚無確切有效的治療方法［3］。內耳Corti器是負責哺乳動物聽覺的感覺器官，耳蝸上皮中分化出的感覺毛細胞和支持細胞之間進行的復雜的排列組合對于內耳功能極為關鍵［4］。在螺旋器發(fā)育的類似成神經階段，Atoh1可控制支持細胞分化并最終形成一排內毛細胞和三排外毛細胞模式。Pou4f3、Gfil、Barhl1是三種已被證實與毛細胞生存和維護相關的基因，它們在維持毛細胞結構形態(tài)的過程中發(fā)揮重要作用，然而這些基因的作用發(fā)揮都是在Atoh1基因協(xié)同下完成的。Atoh1作為正性調控基因，可通過調控POU4F3或其他基因來掌控毛細胞分化。Atoh1突變小鼠內耳上皮Gfi1蛋白表達量呈急劇下降趨勢，Atoh1基因缺陷可導致Barhl1表達喪失［5～8］?？梢夾toh1在對毛細胞形態(tài)和功能再生過程中必不可少的基因。

一定數(shù)量的健康毛細胞及螺旋神經節(jié)細胞對于神經性耳聾疾病的治療后聽力的提高十分重要［9］。若能將干細胞在一定條件下成功誘導分化成新生毛細胞并移植于內耳，則可解決耳蝸毛細胞損傷后再生的種細胞來源不足的難題。為了更進一步研究Atoh1基因在干細胞中的作用機制及生物活性，本實驗擴增出的Atoh1基因測序結果顯示克隆的編碼序列與參考序列所編碼的氨基酸序列一致，兩者同源性99%，相似性100%，兩處突變?yōu)闊o義突變，突變堿基與未突變堿基的含義相同。證明本研究成功克隆了大鼠Atoh1基因編碼序列。

本實驗采用的T載體p MD－19T Vector是進行EcoR V酶切后，再在兩側的3′端添加“T”的線性載體。Taq DNA聚合酶進行PCR反應后可在PCR產物的3′末端添加一個“A”，這能更好的保證PCR產物與T載體的高效連接。本實驗采用作為標記重組表達質粒的報告基因EGFP是一類提取于發(fā)光水母體內的生物發(fā)光蛋白，無種屬特異性，且無須抗體、輔因子或酶底物等其他介質，當受到紫外或藍光激發(fā)時發(fā)射綠色熒光。EGFP作為“生物熒光標簽”能方便地監(jiān)測其在活細胞和生物體中的動態(tài)定位和代謝情況，其熒光強度比普通綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）高4～35倍，作為報告基因，其敏感性也明顯高于GFP［10］。實現(xiàn)兩個基因在一個細胞中共表達的方法通常是采用一個表達載體上兩個內啟動子，或者是采用融合基因的形式。但上述方法會出現(xiàn)兩種基因表達上較大的差異，有時只表達一個基因或者不能保證目的蛋白的正確折疊。本實驗選用的真核表達載體pIRES2－EGFP中含有腦心肌炎病毒的內部核糖體進入位點（internal ribosome entrysite.IRES），IRES連接兩個開放讀碼框，其轉錄產物在翻譯時，核糖體能同時進入并開始翻譯IRES上游及下游的兩個轉錄子［11］。在CMV啟動子下游MCS中的Sal I和Bam H I之間插入Atoh1基因，構建p Atoh1－IRES2－EGFP質粒，在Atoh1和EGFP基因之間巧妙地利用了IRES，IRES允許克隆入多克隆位點的目的基因和EGFP基因從同一個雙順反子mRNA進行翻譯，也支持兩個目的基因同時并且同水平表達，翻譯出來的目的蛋白就各具獨立的空間結構和生理活性，而不是融合蛋白，以利于蛋白的正確折疊［12］。由于兩者共用一個啟動子，因此所有表達選擇標記的轉染細胞必然也同時表達目的基因，這樣就解決了在同一個載體上插入兩個基因后可能發(fā)生的兩個基因互相干擾而不能表達的問題。

利用Atoh1基因轉染毛細胞前體細胞或多能干細胞轉分化為類毛細胞的研究，雖然已經取得了一定的進展，但是誘導毛細胞再生和移植成活毛細胞的臨床應用仍相當遙遠。本實驗結果證明成功克隆了Atoh1基因的編碼序列，并正確構建了真核表達質粒p Atoh1－IRES2－EGFP。經過脂質體介導轉染293T細胞48h后，在激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光蛋白表達，為進一步研究Atoh1的表達及生物活性奠定了基礎，也為感音神經性聾基因治療提供了實驗依據(jù)。

1 Rose MF，Ahmad KA，Thaller C，et al.Excitatory neurons of the proprioceptive，interoceptive，and arousal hindbrain networks share a developmental requirement for Math1［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2009，106：22 462.

2 Kanzaki S，Beyer LA，Swiderski DL，et al.p27（Kip1）deficiency causes organ of Corti pathology and hearing loss［J］.Hear Res，2006，214：28.

3 Kawamoto K，Ishimoto S，Minoda R，et al.Math1 gene transfer generates new cochlear hair cells in mature guinea pigs in vivo［J］.Neurosci，2003，23：4 395.

4 Zheng GX，Zhu K，Wei JJ，et al.Adeno－associated viral vector－mediated expression of NT4－ADNF－9 fusion gene protects against aminoglycoside－induced auditory hair cell loss in vitro［J］.Acta Otolaryngol，2011，131：136.

5 Sud R，Jones CM，Banfi S，et al.Transcriptional regulation by Barhl1 and Brn－3c in organ－of－Corti－derived cell lines［J］.Brain Res Mol Brain Res，2005，141：174.

6 Izumikawa M，Minoda R，Kawamoto K，et a1.Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atohl gene the-rapy in deaf mammals［J］.Nat Med，2005，11：271.

7 Kirjavainen A，Sulg M，Heyd F，et al.Prox1 interacts with Atoh1 and Gfi1，and regulates cellular differentiation in the inner ear sensory epithelia［J］.Dev Biol，2008，322：33.

8 Scheffer D，Sage C，Corey DP，et al.Gene expression profiling identifies Hes6 as a transcription－al target of ATOH 1 in cochlear hair cells［J］.FEBS Lett，2007，581：4 651.

9 李利，趙立東，邢光前，等.胚胎干細胞向內耳毛細胞誘導分化的研究進展［J］.聽力學及言語疾病雜志，2010，18：293.

10 劉英鵬，王國鵬，沈安民，等.重組腺病毒構建及介導報告基因在豚鼠耳蝸中的表達［J］.臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2007，21：748.

11 Malygin AA，Bochkaeva ZV，Bondarenko EI，et al.Binding of the IRES of hepatitis C virus RNA to the 40S ribosomal subunit：role of protein p40［J］.Mol Biol（Mosk），2009，43：1 070.

12 Riesenberg AN，Liu ZY，Kopan R，et al.Rbpj cell autonomous regulation of retinal ganglion cell and cone photoreceptor fates in the mouse retina［J］.J Neurosci，2009，29：12 865.

（2011－03－07收稿）

（本文編輯 雷培香）

Construction of A Recombinant Eukaryotic Vector of Atoh1 and Its Expression in 293－T Cells

Zheng Guoxi，Zhu Kang，Hou Jin，Zhu Zhu，Wei Junrong，Xu Min
（Department of Otolaryngology－Head and Neck Surgery，the Second Affiliated Hospital，Medical School of Xi’an Jiaotong University，Xi’an，71004，China）

Objective Useing gene engineering technique to clone SD rats Atoh1 cDNA coding sequence and construct the Eukaryotic expression vector for its expression in eukaryotic cells.Methods Total RNA was extracted from colon of SD rats，by means of asymmetrical primer／template，double stranded cDNA of Atoh1 was gained，then the c DNA coding sequence was cloned into PMD－19T vector and sequenced.The purified digested fragment was connected into Eukaryotic expression vector pIRES2－EGFP with the EGFP gene and the internal ribosomes site（IRES）.Recombinant plasmid was identified by enzyme digestion and sequence analysis，and thea was transfected into 293T cells with Lipofectamine and the expression of protein was detected by fluorescence microscope and Western blotting.Results DNA sequence analysis showed that rat Atoh1 gene amplified length of CDS area 1056bp，encoding 351 amino acids，and contrast the reference sequences published in GeneBank，there were two base mutation in the sequence，it may be Single nucleotide polymorphisms in the nucleotide to induce nonsense mutation，deduced amino acid of cloning sequences as the same as reference sequences.Two bases were single nucleotide polymorphism（SNP），and mutation was a nonsense mutation，did not affect protein expression.Enzyme digestion and sequence analysis of recombinant plasmid demonstrated that Atoh1 gene was correctly inserted into eucaryotic expression vector plRES2－EGFP.The expression of the green fluorescent protein in the293T cells was observed by fluorescence microscopeafter recombinant plasmid into 293T cells 48 h.The mRNA and protein expression of Atohl in infected 293T had been comformed by Western blotting.Conclusion Atoh1 CDS region was cloned and recombinant plasmid has been constructed successfully，and the Atoh1 of pIRES2－EGFP－Atoh1 was successfully expressed in the 293T cells，which will guide further research on genetherapy for sensorineural hearing loss.

Sensorineural hearing loss； Atoh1； Gene； Clone； Eukaryotic expression vector

10.3969／j.issn.1006－7299.2011.05.015

時間：2011－9－5 12：50

R764.3

A

1006－7299（2011）05－0438－06

* 國家自然科學基金（NO.30471877）、陜西省科技攻關項目（NO.2010K15－08）資助

1 西安交通大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外病院（西安 710004）

鄭國璽，男，西安人，醫(yī)學博士，教授，主要從事耳病和神經生物學研究。

鄭國璽（Email：zhengguoxi＠21cn.com）

網絡出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／42.1391.R.20110905.1250.008.html