結(jié)核分支桿菌耐異煙肼分子機(jī)制的研究

孫鳳丹 李月龍 韓忠波

異煙肼(INH)作為最主要的一線抗結(jié)核藥物之一，對其耐藥性的研究日益受到重視。國外也有報道認(rèn)為結(jié)核分支桿菌耐異煙肼的產(chǎn)生是過氧化氫酶-過氧化物酶的編碼基因KatG基因的缺失和突變有關(guān)，與inhA基因突變也有相關(guān)性［1］。我們采用采用PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(PCR-SSCP)方法檢測了95株肺結(jié)核患者痰標(biāo)本臨床分離株，并對47例結(jié)核患者痰標(biāo)本直接進(jìn)行KatG基因、inhA基因突變檢測，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 95株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株和47例肺結(jié)核患者涂陽痰標(biāo)本。95株臨床分離株按結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)規(guī)程進(jìn)行菌種鑒定及藥敏實驗證實為結(jié)核分支桿菌，其中51株對異煙肼耐藥，44例對異煙肼敏感。47例肺結(jié)核患者涂陽痰標(biāo)本根據(jù)臨床癥狀、涂片結(jié)果、胸部X線和培養(yǎng)結(jié)果確診，其中18例對異煙肼耐藥，29例對異煙肼敏感。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 用傳統(tǒng)酚/氯仿抽提法提取標(biāo)本中 DNA［2］。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 采用25ul反應(yīng)體系，4xdNTPs終濃度為0.2 mm01/l，引物終濃度為0.2 umol/L，擴(kuò)增程序為94℃變性1 min，61℃退火1 min，72℃延伸 l min，循環(huán) 30 次，最后 72℃延伸l0 min。擴(kuò)增產(chǎn)物擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳。紫外檢測rPOB出現(xiàn)258bp條帶、KatG出現(xiàn)282bp條帶、rpsL出現(xiàn)267bp條帶即為擴(kuò)增陽性。

1.2.3 SSCP銀染 PCR擴(kuò)增陽性的標(biāo)本進(jìn)行SSCP檢測，擴(kuò)增產(chǎn)物加等量甲酰胺變性液95℃變性10 min，立即冰浴5 min，在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳，條件為6℃100 V電壓，電泳約2～3 h，電泳結(jié)束后.，取凝膠板經(jīng)硝酸銀染色，觀察結(jié)果并照相。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增，以結(jié)核分支桿菌H37RV為對照，44株藥物敏感株、51株耐INH分離株KatG、inhA基因擴(kuò)增均為陽性;47例耐INH肺結(jié)核患者痰標(biāo)本中，KatG基因44例擴(kuò)增陽性、inhA基因40例擴(kuò)增陽性(見表1)。

2.2 應(yīng)用PCR-SSCP技術(shù)檢測KatG、inhA基因突變結(jié)果(見表1、2)。44株藥物敏感株的KatG、inhA基因突變率分別為4.5%、0。51株耐INH分離株中，31株KatG基因發(fā)生突變，突變率為60.8%;3株inhA基因發(fā)生突變，突變率為5.9%。耐INH肺結(jié)核患者痰標(biāo)本中，基因突變檢測率分別為47.7%、7.5%。

表1 對47例肺結(jié)核患者痰標(biāo)本的檢測結(jié)果

表2 對95例臨床分離株的檢測結(jié)果

3 討論

近年來，耐藥結(jié)核病病情逐年上升，特別是對異煙肼和利福平耐藥的耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)的增多，是影響結(jié)核病化療效果的主要原因。因此，建立一種新的快速，有效的藥敏試驗方法對結(jié)核病的早期治療具有重要的意義。有研究表明［3］結(jié)核分桿菌耐異煙肼的產(chǎn)生與過氧化氫酶一過氧化物酶的編碼基因KatG基因的缺失和突變有關(guān)，與inhA基因也有相關(guān)性。本實驗PCR-SSCP方法得出耐異煙肼時，KatG基因突變率為60.8%、inhA基因突變率為5.9%。表明KatG基因突變是結(jié)核分支桿菌耐異煙肼臨床分離株主要的基因突變類型。說明KatG在INH耐藥中起主導(dǎo)作用，但某些菌株的耐INH形成可能與KatG無關(guān)。KatG基因突變是INH耐藥性的重要分子機(jī)制，inhA基因與INH耐藥性有相關(guān)性。

由于有90-95%的耐利福平株同時也耐INH，這樣單獨進(jìn)行INH的藥物敏感性分析可初步制定細(xì)菌的耐藥譜。同時檢測了47例耐INH肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本，44例擴(kuò)增陽性的耐INH痰本KatG基因突變率為47.7%、inhA基因突變率為7.5%，說明應(yīng)用PCR和PCT-SSCP技術(shù)可以簡便、快速直接檢測未經(jīng)培養(yǎng)的痰標(biāo)本中結(jié)核分支桿菌KatG基因突變，為臨床檢測結(jié)核分支桿菌耐異煙肼的耐藥性提供了初步依據(jù)。

［1］ Pretorius QS，Van Helden PD，Strge1 F，et al.Matation in Katg gene，Antimicrob，Agents Chenother，1995，39(10):2276.

［2］ 張小剛，何秀云，等.結(jié)核分支桿菌耐鏈霉素耐藥基因的檢測.實用醫(yī)學(xué)雜志，2001，17(10):1006-1007.

［3］ 張宗德，馬與，程紹基，等.異煙肼耐藥與結(jié)核分支桿菌KatG基因突變的研究.中華結(jié)核和呼吸雜志，1996，19(6):346-349.