硫酸鋅對鎘染毒至臍靜脈內皮細胞損傷的影響

詹杰 柳承希 李延龍 魏樹和 張靜生

鎘(Cd)是常見的環(huán)境和工業(yè)毒物，可通過食物、飲水、吸煙等途徑進入人體。一般認為其生物半衰期長達10～35年，很少量的鎘進入體內就可因為生物蓄積和生物放大作用對機體產生一系列的損傷作用，因而鎘被美國毒物管理委員會(ATSDR)列為第六位危機人體健康的有毒物質。近年研究表明，鎘的毒害作用也是引起動脈硬化、高血壓等心腦血管的原因之一，因此研究鎘中毒性動脈硬化致病機制及防治方法有重要的實際意義。鋅是人體必需元素，參與酶分子結構、基因表達、信號傳導、細胞黏附、mRNA更新、抗氧化等多種生理功能，缺鋅與血管硬化和心臟病發(fā)生有關［1］。本文利用人臍靜脈內皮細胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVECS)體外培養(yǎng)實驗，觀察鋅對鎘染毒血管內皮細胞的防護作用與可能機制。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 人臍帶靜脈內皮細胞(HUVECS)，遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院科研實驗中心提供。健康Wister大鼠36只(動物合格證號:SCXK(遼)2003-0016)，雄性，體質量300 ～350 g。

1.1.2 試劑 DMEM(GIBCO公司);無菌滅活小牛血清(GIBCO公司);NO試劑盒(南京建成生物公司);人sICAM-1ELISA試劑盒、人細胞色素C ELISA試劑盒(上海瑞齊生物公司);Annexin V/PI凋亡試劑盒(北京寶賽生物公司)。氯化鎘、硫酸鋅等試劑均為分析純。

1.1.3 儀器 酶標儀(BID RAD);724型可見光分光光度計(上海分析儀器);CO2培養(yǎng)箱(THERMO);IX-70熒光倒置顯微鏡(Olympus日本);高速冷凍離心機(SIGMA);雙人凈化臺(蘇州凈化);流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 共分3組?？瞻捉M(normal group，NG):空白血清處理的 HUVECSS細胞;模型組(Cd):1、5、10、30和60 μm不同濃度鎘(Cdcl2)血清處理的HUVECSS細胞;補鋅組(Cd+Zn):不同濃度鎘及硫酸鋅血清處理的HUVECS細胞。

1.2.2 藥物血清制備 按藥物血清制備通法，補鋅組按人的每天等效劑量的10倍硫酸鋅濃度1 mg/ml，2 ml/(次·只)灌胃，正常對照組和模型組以0.9%氯化鈉注射液等量灌胃，1次/d，連續(xù)3 d，末次灌胃給藥1 h后腹主動脈采血，分離血清，-85℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 細胞培養(yǎng)及細胞損傷模型的建立 HUVECS細胞株，采用2.5 g/L胰酶消化，加入含20%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，置于37℃CO2培養(yǎng)箱中進行傳代培養(yǎng)，至細胞呈單層鋪路石樣融合狀態(tài)后，再用2.5 g/L胰蛋白酶消化，得到細胞懸液。將細胞懸液調整為5×105/ml，接種于24及96孔板，加入各組藥物血清，培養(yǎng)48 h后進行指標測試。

1.3 指標檢測

1.3.1 硝酸還原酶法 測定NO:取細胞培養(yǎng)液100 μl，于波長550 nm測定吸光度，計算細胞培養(yǎng)液中NO含量。

1.3.2 ELISA法 采用酶聯(lián)免疫雙抗體夾心法測定細胞培養(yǎng)上清液中可溶性細胞間黏附分子1(sICAM-1)和細胞色素C(Cyt C)的含量。每組設3復孔，分別用酶標儀450 nm波長下測定吸光度，按標準曲線計算出待測樣品中sICAM-1和Cyt C的含量。

1.3.3 流式細胞儀 Annexin V/PI-FITC染色法分析細胞凋亡率:取上述分組1 ml細胞，1000 rpm，4℃離心10 min，棄上清;加入1 ml冷的PBS，輕輕震蕩使細胞懸浮;1000 r/min 4℃離心10 min，棄上清，重復兩次。將細胞懸浮于200 μl的binding buffer;加入 10 μl Annexin V-FITC 和 5 μl PI，輕輕混勻，避光室溫反應15 min;加入300 μl的binding buffer后用流式細胞儀檢測(Ex=488 nm;Em=530 nm)細胞凋亡的情況，判定早期及晚期凋亡率。將細胞混合液離心，取細胞沉淀涂片，熒光顯微鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0軟件包進行多因素方差分析及LSD兩兩比較。實驗數(shù)據(jù)以均值±標準差()表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 對鎘染毒血管內皮細胞損傷后的NO、sICAM-1和Cyt C的影響(表1) 鎘染毒的血管內皮細胞NO值明顯低于正常對照組(P＜0.01)，sICAM-1濃度和Cyt C值明顯升高(P＜0.01);而鎘染毒同時補充硫酸鋅組血管內皮細胞的損傷明顯減輕，NO值明顯高于Cd組(P＜0.01)，sICAM-1濃度和Cyt C值明顯降低(P＜0.01);其中，Cd+Zn組NO和Cyt C濃度(60 μm除外)與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

2.2 流式細胞術Annexin V/PI染色法分析細胞凋亡率(表2，圖3) 按照Annexin V/PI-FITC熒光染色結果的判定標準，對實驗散點圖相應數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，結果顯示，正常對照組的早期與晚期凋亡率即LR與UR之和為(5.28±2.44)%，與正常對照組相比，鎘染毒組 5、10、30、60 μm 的早期與晚期凋亡率之和均顯著增加(P＜0.01)，其中鎘染毒60 μm組高達(39.49±39.03)%，而Cd+Zn組處理后，此數(shù)值顯著下降(P＜0.01)，與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

表1 鋅對鎘染毒血管內皮細胞損傷后NO、sICAM-1和Cyt C的影響()

表1 鋅對鎘染毒血管內皮細胞損傷后NO、sICAM-1和Cyt C的影響()

注:與空白對照組比較，*P＜0.01;與模型組比較，△P＜0.01

鎘(μm)NO(μmol/L)sICAM-1(ng/L)Cyt C(nmol/L)Cd Cd+Zn Cd Cd+Zn Cd Cd+Zn NG 84.53±2.14 38.55±2.12 15.91±0.781 36.67±3.52* 90.43±4.21△ 50.25±3.71* 48.02±4.29* 31.13±1.44* 19.97±2.02△5 35.05±3.07* 89.06±3.27△ 65.17±6.01* 50.34±3.71＊△ 35.69±5.42* 19.47±4.01△10 34.19±4.43* 90.51±3.11△ 69.18±4.89* 50.61±4.11＊△ 38.87±3.71* 20.53±5.66△30 33.25±3.89* 81.19±2.56△ 71.32±5.46* 52.57±4.02＊△ 38.92±3.90* 20.78±7.10△60 29.91±5.18* 69.23±4.37△ 82.86±6.37* 55.88±6.13＊△ 45.53±7.74* 23.35±4.16＊△

表2 鋅對鎘染毒血管內皮細胞凋亡率的影響()

表2 鋅對鎘染毒血管內皮細胞凋亡率的影響()

注:與空白組比較，*P＜0.01;與模型組比較，△P＜0.01

LR+UR(%Gated)0 μm 1 μm 5 μm 10 μm 30 μm 60 μm 5.28±2.44 - - - - -Cd組 - 5.57±4.08 12.44±4.44* 13.97±5.81* 16.09±6.22* 39.49±39.03*Cd+Zn組 - 2.80±4.02 2.51±4.58△ 3.06±2.23△ 4.30±3.82△ 4.36±2.25空白組△

圖1 Annexin V/PI染色法細胞凋亡率比較

3 討論

鋅是一種人體必需的微量元素，已知六大類、300多種酶的活性中心都有鋅的存在。鋅可調節(jié)基因表達，一些蛋白質的特定序列可與鋅結合產生鋅指結構序列(Zinc finger motif)，后者可與DNA特異序列結合，在基因轉錄調控中起重要作用。此外，鋅還參與信號傳導、細胞黏附、mRNA更新、穩(wěn)定膜結構、增強膜結構的抗自由基能力等重要生理功能［1］。

研究證實，鎘對人體具有多器官、多系統(tǒng)毒性，其毒性機制與誘發(fā)過氧化物生成、引起DNA損傷、線粒體受損、干擾細胞信號傳導系統(tǒng)等多途徑有關，機制十分復雜［1］。舒張和收縮因子、促凝和抗凝因子及生長抑制和生長促進因子的平衡失調導致血管內皮功能障礙、單核細胞與血管內皮細胞黏附，以及血管內皮細胞與平滑肌的凋亡均可能是各器官鎘染毒損傷的重要機制之一。內皮源性NO是天然血管保護劑和抗動脈硬化分子，病變血管內皮NO合成下降和破壞增多是內皮依賴性血管舒縮異常的主要原因［2，3］。黏附分子sICAM-1在血管內皮損傷過程中，通過信號分子傳遞，激活轉錄因子NFKB，與靶基因細胞黏附分子基因位點結合，上調內皮細胞的黏附分子基因及黏附分子的表達，并介導單核細胞黏附、遷移穿過內膜，始動AS早期的細胞行為［4］。而Cyt C的釋放被認為是細胞凋亡程序中的關鍵一步，在凋亡初期，Cyt C從線粒體內膜釋放，從而啟動了線粒體的凋亡機制［5］。

本實驗觀察到內皮細胞鎘染毒損傷24 h后，sICAM-1含量明顯增加，NO水平下降，Cyt C濃度上升，且有與鎘水平呈正相關趨勢，5 μm水平以上鎘可引起內皮細胞的凋亡率明顯增加。Zn可升高NO水平，sICAM-1、Cyt C含量均明顯下降，內皮細胞凋亡率明顯降低，提示鎘染毒同時補鋅可抑制由鎘染毒造成的內皮功能障礙和內皮細胞凋亡，抑制了單核-內皮細胞黏附，保護內皮細胞，進而減少AS的發(fā)生。其作用機制、量效關系和安全性值得進一步研究。

［1］余元勛，胡玲玲，余國斌主編，中國醫(yī)學分子微量元素學，安徽科學技術出版社，2009.

［2］Moncada S，Nitric oxide.Journal of Hypertension，1994，12(810):S35-39.

［3］Meredith IA，Yeung AC，Weidinger EF，et al.Role of impaired endothelium dependent vasodilation in ischemic manifestation of coronary artery disease.Circulation，1993，87(Suppl):56-66.

［4］Rahman A，AnwarKN，Minhajuddin M，et al.cAMP targeting of p38 MAP kinase inhibits thrombininduced NF-κB activation and ICAM-1 expression in endothelial cells.American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology，2004，287(5):1017-1024.

［5］Morita-Fujimura Y，F(xiàn)ujimura M，Kawase M，et al.Release of mitochondrial cytochrome C and DNA fragmentation after cold injuryinduced brain trauma in mice:possible role in neuronal apoptosis.Neuroscitt，1999，267(3):201-205.