中國美利奴羊CTNNB1基因SNP與羊毛直徑關(guān)聯(lián)分析

張艷花，王力儉，徐新明，瑪爾孜亞，于麗娟，拉扎提，阿扎提，周喜榮，田可川

（新疆維吾爾自治區(qū)畜牧科學(xué)院，烏魯木齊 830000）

近年來細(xì)毛羊育種者不斷探索通過分子育種手段尋找控制羊毛纖維直徑性狀的基因或標(biāo)記來提高育種效率［1］。CTNNB（β-catenin）基因作為影響毛囊發(fā)育的 Wnt蛋白信號(hào)［2］通路中心環(huán)節(jié)［3-4］，對毛囊發(fā)育、毛囊生長起著重要作用［5］。研究發(fā)現(xiàn)WNT/β-catenin對毛囊再生時(shí)真皮乳頭的誘導(dǎo)特性的維持是必要的，毛囊形態(tài)發(fā)生過程和毛囊再生形態(tài)和信號(hào)的表達(dá)具有很大的相似性，β-catenin在表皮層化后未出現(xiàn)基板形態(tài)之前首次均一散在出現(xiàn)于臨近表皮的真皮間充質(zhì)細(xì)胞。隨著表皮基板增厚，基板部位β-catenin信號(hào)的上調(diào)，散在表達(dá)的WNT/β-catenin 信號(hào)消失［7］。基板形成后，基板下部開始聚集的間充質(zhì)細(xì)胞，間充質(zhì)細(xì)胞聚集一定數(shù)量后也開始表達(dá)β-catenin。隨后毛囊開始下陷，形成毛芽。伴隨著毛囊下陷，β-catenin表達(dá)消失一段時(shí)間；毛囊成形后毛球部位出現(xiàn)毛囊圓錐時(shí)再次在圓錐部位出現(xiàn)。隨后毛母質(zhì)、前皮質(zhì)區(qū)、根鞘都出現(xiàn)WNT/β-catenin信號(hào)的表達(dá)上調(diào)。這種上調(diào)表達(dá)一直持續(xù)到毛囊成熟毛纖維形成毛干［4］。但CTNNB1基因作為影響羊毛直徑性狀的候選基因在國內(nèi)尚未見有關(guān)研究報(bào)道。本研究擬通過以CTNNB1基因?yàn)楹蜻x基因，利用中國美利奴羊中發(fā)現(xiàn)的多態(tài)位點(diǎn)，運(yùn)用最小二乘均值分析各多態(tài)位點(diǎn)與產(chǎn)毛性狀之間的關(guān)系，找到與產(chǎn)毛性狀相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記位點(diǎn)，以進(jìn)一步提高細(xì)毛羊的生產(chǎn)性能，改善羊毛品質(zhì)，為細(xì)毛羊經(jīng)濟(jì)性狀的早期標(biāo)記輔助選擇提供理論依據(jù)和技術(shù)貯備。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源及采樣方法 實(shí)驗(yàn)采集新疆鞏乃斯種羊場有系譜記錄的中國美利奴羊874只，實(shí)驗(yàn)羊群體為周歲母羊。一次性針頭采集羊頸靜脈血液2mL，放入醫(yī)用肝素鈉抗凝試管，上下顛倒5次確?？鼓?，放入-20℃冰箱保存。同時(shí)采集每一只羊體側(cè)毛樣，用光學(xué)纖維直徑分析儀（OFDA100）測定分析該毛樣羊毛平均纖維直徑。

1.1.2 主要試劑 DP319血液基因組DNA提取系統(tǒng)、dNTPs、TaqDNA聚合酶、TaqDNA聚合酶反應(yīng)緩沖液、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（MarkerⅠ、MarkerⅣ）均購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組提取 采用天根生化科技（北京）有限公司DP319血液基因組DNA提取系統(tǒng)，提取基因組DNA。應(yīng)用紫外分光光度計(jì)和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度并估計(jì)含量，利用核酸蛋白定量儀測定其含量，稀釋到 100 ng/μL。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)Genbank公布的羊CTNNB1基因，得到mRNA部分序列（GQ372826.1），長度約為407bp，在NCBI及UCSC上查找比對，尋找與該基因同源性較高的物種的基因，通過比對發(fā)現(xiàn)綿羊CTNNB1基因mRNA序列與牛CTNNB1基因高度同源。以牛CTNNB1基因?yàn)閰⒖夹蛄?，以羊的mRNA部分序列為模板，分3段設(shè)計(jì)引物。利用在線引物設(shè)計(jì)程序（http：//fokker.wi.mit.edu/primer3/input.htm）初步設(shè)計(jì)了32對引物，通過oligo6軟件檢測，選取合適引物6對，通過實(shí)驗(yàn)篩選，最終確定了3對引物，如表1所示。

表1 CTNNB1基因測序引物序列

1.2.3 PCR過程 利用設(shè)計(jì)的3對引物進(jìn)行擴(kuò)增。預(yù)期的PCR產(chǎn)物長度為300 bp、1 200 bp、2 000 bp。反應(yīng)體系：l0×Buffer擴(kuò)增緩沖液2.0 μL，Mg2+（25 mM）1.2 μL，dNTP 混合物（2.5 mM）1.5 μL，10 pmol/μL 上下游引物各1.0 μL，TaqDNA 聚合酶（5u/μL）0.2μL，模板 DNA（100 ng/μL）1.0 μL，ddH2O 12.1μL。反應(yīng)條件：①200～600 bp 片段，95 ℃ 5 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán)；②1 000～2 500 bp 片段，95 ℃ 8 min；95℃ 45 s，55 ℃45 s，72℃2.5 min，38個(gè)循環(huán)。根據(jù)擴(kuò)增效果篩選3對引物用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 SNP位點(diǎn)篩選及分型檢測 隨機(jī)從13個(gè)不同公羊的女兒中，選取羊毛纖維直徑差異較大的40個(gè)個(gè)體的基因組，從每個(gè)DNA樣本中選取5 μL共200 μL的DNA混合構(gòu)建成DNA池。選取擴(kuò)增效果較好的3對引物進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物分裝，各30 μL分別送至擎科生物公司及華大公司測序，分析測序峰圖查找SNP位點(diǎn)。根據(jù)檢測結(jié)果，使用美國西昆諾姆公司的Mass ARRAY對實(shí)驗(yàn)群體進(jìn)行SNP分型檢測，然后統(tǒng)計(jì)基因型。

1.3 數(shù)據(jù)分析 統(tǒng)計(jì)不同基因型的個(gè)體數(shù)量，計(jì)算基因頻率和基因型頻率，利用Popgene Version（3.2）軟件對SNP位點(diǎn)進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。

采用SAS8.2中的MIXED過程對中國美利奴羊CTNNB1基因SNP位點(diǎn)多態(tài)性與羊毛纖維直徑、羊毛纖維直徑變異系數(shù)和羊毛產(chǎn)量性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，具體公式為：

其中，y為性狀表型觀察值；μ為性狀的群體均值；RAM為公羊家系；G為SNP效應(yīng)；e為隨機(jī)殘差效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CTNNB1基因SNP位點(diǎn)多態(tài)性檢測 對混合池基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)行正反向測序。用Chromas軟件打開測序峰圖，用DNAMAN進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)了2個(gè)SNP突變位點(diǎn)，分別是819G＞A、974A＞G。

圖1 CTNNB1基因池的測序峰圖（圈圖處為突變位點(diǎn)，為反向測序結(jié)果）

2.2 CTNNB1基因SNP位點(diǎn)等位基因頻率和基因型頻率分析 CTNNB1基因的2個(gè)SNP多態(tài)位點(diǎn)中819G＞A突變位點(diǎn)處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，974A＞G位點(diǎn)處于極不平衡狀態(tài)，突變位點(diǎn)G等位基因頻率（0.30）明顯低于野生型A等位基因頻率（0.70）。

表2 SNPs等位基因頻率和基因型頻率及Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

2.3 基因多態(tài)性羊毛直徑性狀的關(guān)聯(lián)分析 多重比較分析表明，CTNNB1基因974A＞G位點(diǎn)的AA基因型羊毛纖維直徑顯著低于GG及GA基因型、819G＞A位點(diǎn)的GA基因型羊毛纖維直徑顯著低于AA基因型。等位基因替代效應(yīng)分析表明CTNNB1基因819G＞A位點(diǎn)對羊毛纖維直徑加性效應(yīng)達(dá)到極顯著水平，顯性效應(yīng)達(dá)到顯著水平，等位基因由A變?yōu)镚時(shí)羊毛纖維直徑會(huì)降低。

表3 CTNNB1基因SNP位點(diǎn)對羊毛纖維直徑性狀的影響

表4 CTNNB1基因SNP位點(diǎn)在羊毛纖維直徑性狀上的加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)

3 討論

1）CTNNB1基因作為影響羊毛直徑性狀的候選基因，在國內(nèi)屬首次研究。本研究發(fā)現(xiàn)CTNNB1基因上與羊毛纖維直徑相關(guān)的2個(gè)SNP突變位點(diǎn)，表明CTNNB1基因與羊毛纖維直徑性狀有著較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)。

2）本研究首次發(fā)現(xiàn)CTNNB1基因上819G＞A位點(diǎn)GA基因型羊毛纖維直徑顯著低于AA基因型，974A＞G位點(diǎn)的AA基因型羊毛纖維直徑顯著低于GG及GA基因型。因此CTNNB1基因作為新的影響羊毛纖維直徑的候選基因值得進(jìn)一步探討，本研究為CTNNB1基因位點(diǎn)應(yīng)用于羊毛纖維直徑標(biāo)記輔助選擇提供了一定的參考。此外作為影響毛囊發(fā)育的Wnt蛋白信號(hào)通路中心環(huán)節(jié)基因CTNNB1，值得進(jìn)一步采取定量分析研究其影響羊毛纖維直徑的機(jī)理。

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