響應(yīng)面法優(yōu)化紅樹莓色素的納濾濃縮條件

王金玲，毛鳳彪，2，王振宇

（1.東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，哈爾濱 150040；2.深圳華大基因研究院，深圳 518083）

樹莓（RubusideausL.）為薔薇科懸鉤子屬植物，灌木性果樹。樹莓果實(shí)具有很高的營養(yǎng)保健和藥用價值，除了富含氨基酸、礦質(zhì)元素、有機(jī)酸和VC、VE等人體必需的營養(yǎng)素外[1]，還含有豐富的紅色素，據(jù)文獻(xiàn)報道，其含量為10～2199mg／100g fw 不等[2－5]。樹莓紅色素具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗病毒、強(qiáng)化免疫系統(tǒng)功能、改善血液循環(huán)、降低血壓等作用[3－8]；樹莓是近年來備受研究者關(guān)注的漿果之一，將會成為未來的健康食品。

納濾（nanofiltration，NF）膜是20世紀(jì)80年代末期問世的新型分離膜，它的截留分子量介于反滲透膜和超濾膜之間，約為200～1000；納濾膜主要依據(jù)于篩分效應(yīng)和電荷效應(yīng)進(jìn)行物質(zhì)分離[9]。近年來，對于納濾技術(shù)應(yīng)用于果汁的濃縮及活性物質(zhì)的濃縮，如多糖、肽、黃酮、多酚等[10－12]領(lǐng)域已成功運(yùn)用，但是應(yīng)用于天然色素的濃縮純化，尚未見報道。

東北地區(qū)野生樹莓資源豐富，近幾年又開展了大面積的人工種植，提取并純化樹莓色素，應(yīng)用于食品工業(yè)具有廣闊的發(fā)展空間。本研究旨在對紅樹莓果實(shí)中提取的色素進(jìn)行納濾濃縮純化，得到納濾法最佳濃縮工藝，為紅樹莓色素在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

紅樹莓鮮果，市售；蒸餾水洗凈，濾紙吸去蒸餾水，去除雜物；使用95%乙醇為提取劑，采用提取溫度72.4℃，提取時間60min，料液比為1∶8.5，pH為2.0的條件提取。將提取液進(jìn)行紗布過濾后抽濾，除去沉淀，測得樹莓提取原液花色苷質(zhì)量濃度為12.22mg／mL，4℃保存?zhèn)溆谩Ｔ囼?yàn)中所用其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器設(shè)備

YP2001N 電子天平、PHS-25 數(shù)顯 pH 計、TU-1810紫外可見分光光度計均為上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；DK-98-1電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；納濾膜分離裝置：膜截留分子量為300道爾頓，上海摩速科學(xué)器材有限公司。

1.3 方法

1.3.1 單因素試驗(yàn)

選取對納濾有較大影響的因子進(jìn)行單因素試驗(yàn)以確定各因素的取值范圍。這些因素為：納濾溫度、壓力、色素溶液pH、進(jìn)料質(zhì)量濃度（以樹莓提取原液濃度為100%）。恒定進(jìn)料體積和納濾時間，在其他因子固定的情況下變化待測定因子，測定納濾前后色素溶液的吸光度。單因素試驗(yàn)選取的因子及水平見表1。

具體操作方法如下：初始納濾條件為納濾溫度20℃，壓力0.6MPa，色素溶液pH 為3，質(zhì)量濃度100%，進(jìn)料體積為550mL，納濾時間為15min，納濾方式為不加水循環(huán)式。

1.3.2 響應(yīng)面設(shè)計

通過上述單因素試驗(yàn)所得的結(jié)果，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計[13]選取單因素所研究的進(jìn)料質(zhì)量濃度、pH、溫度、壓力四個因素，設(shè)定三個水平，優(yōu)化最佳的納濾工藝參數(shù)，每個試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 濃縮度和截留率的計算

濃縮度（濃縮比）＝A2／A1

截留率（回收率）＝（A2×V2）／（A1×V1）×100%

A1為納濾前色素溶液吸光度，A2為納濾后色素溶液吸光度，V1為納濾前色素溶液體積，V2為納濾后色素溶液體積；A2、A1在相同的pH下測定，吸收光波長為514nm。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)采用sas 9.0分析及處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖1 紅樹莓色素納濾濃縮的單因素結(jié)果

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明（圖1），紅樹莓色素納濾純化單因素中，最佳納濾溫度為30℃；納濾膜工作壓力為0.6或0.7MPa時，納濾效果較好，鑒于納濾裝置的最大工作壓力為0.7MPa，選取0.6MPa為納濾壓力；最佳質(zhì)量濃度為80%；最佳色素溶液pH為2.5。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 部分因子試驗(yàn)結(jié)果

表2 部分因子設(shè)計編碼值及水平

表3 部分因子試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

為了快速從多個影響因子中找到對納濾效果影響最大的因子，以單因素試驗(yàn)中獲得的最佳值為基礎(chǔ)，將各因子的最佳值確定為中心值，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)臄U(kuò)充而成為自變量的取值范圍，以響應(yīng)面方法優(yōu)化納濾濃縮純化紅樹莓色素的最佳條件；設(shè)計部分因子試驗(yàn)，各因子編碼值見表2，試驗(yàn)設(shè)計和結(jié)果見表3，分析結(jié)果見表4和表5。

對部分因子試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析表明（表4），pH（X1）和質(zhì)量濃度（X3）對納濾膜濃縮純化樹莓色素在99%和95%的水平上有顯著的影響，而溫度（X2）和壓力（X4）對納濾效果的影響不顯著，各因子間沒有交互作用。由回歸分析結(jié)果可得一次擬合線性回歸方程：

對方程進(jìn)行方差分析（表 5），F(xiàn)＝5.04，P＝0.0080，說明模型在概率α＝0.01水平上足夠顯著擬合試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

對試驗(yàn)數(shù)據(jù)平均值與中心點(diǎn)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值進(jìn)行t－檢驗(yàn)，t－檢驗(yàn)結(jié)果表明，在方差相等和方差不等的條件下，中心試驗(yàn)點(diǎn)平均值和部分重復(fù)試驗(yàn)平均值差異不顯著（P＝0.7104），說明試驗(yàn)的中心點(diǎn)（濃縮度值最大）不在當(dāng)前試驗(yàn)的設(shè)計范圍之內(nèi)，需應(yīng)用最陡爬坡法尋找試驗(yàn)的最優(yōu)空間。

表4 部分因子試驗(yàn)回歸分析表

表5 部分因子試驗(yàn)?zāi)Ｐ头讲罘治霰?/p>

2.2.2 最陡爬坡試驗(yàn)

FFD的檢驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，溫度（X2）和壓力（X4）對納濾效果的影響不顯著，因此固定在零水平。pH（X1）和質(zhì)量濃度（X3）對納濾膜濃縮純化樹莓色素具有顯著的影響，且X1、X3的系數(shù)為正，說明升高pH（X1）和質(zhì)量濃度（X3）對納濾效果的影響效應(yīng)為正。以pH（X1）和質(zhì)量濃度（X3）的中心值為基準(zhǔn)，pH以每次升高0.3為基本步長，質(zhì)量濃度的基本升高步長為4，進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果見表6。

表6 最陡爬坡試驗(yàn)

表6列出了pH和質(zhì)量濃度改變的方向，即pH每次升高0.3，質(zhì)量濃度每次升高4。從表中可以看出，pH3.1，質(zhì)量濃度88，所對應(yīng)的濃縮度（Y）達(dá)到最大為2.094，隨后濃縮度值開始下降，所以pH3.1、質(zhì)量濃度88% 可用作下面優(yōu)化試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

2.2.3 中心組合試驗(yàn)設(shè)計及響應(yīng)面分析

從上述最陡爬坡試驗(yàn)可以看出，響應(yīng)變量Y值已接近最大響應(yīng)區(qū)域。納濾膜濃縮純化樹莓色素的優(yōu)化可以利用中心組合設(shè)計對兩個獨(dú)立的過程變量進(jìn)行優(yōu)化，即對pH和質(zhì)量濃度進(jìn)行中心組合設(shè)計。試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果見表7和表8，數(shù)據(jù)分析見表9和表10。從表9和表10中分析結(jié)果可知，該模型在86.55%概率水平上回歸顯著，因而模型是可行的。該模型的線形項(xiàng)在95%的概率水平上是顯著的，平方項(xiàng)在99%的概率水平上非常顯著，各因素之間沒有交互作用。從對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式回歸，可以得到如下二次多項(xiàng)式方程：

方程中平方項(xiàng)的系數(shù)均為負(fù)值，方程表征的拋物面開口向下（見圖2），有極大值點(diǎn)。因此方程給納濾膜濃縮純化樹莓色素提供了一個較合適的模型。

表7 中心組合試驗(yàn)因子及水平

表8 中心組合試驗(yàn)結(jié)果

表9 中心組合試驗(yàn)回歸分析結(jié)果

從分析結(jié)果還可知，質(zhì)量濃度變化對納濾效果影響非常顯著，對方程 （2）求導(dǎo)，可以得到模型的極大值處，pH和質(zhì)量濃度兩因子編碼值分別為：0.125096（X1）和0.191131（X2），實(shí)際值分別為：pH3.12和質(zhì)量濃度89.53%，此時樹莓提取液中花色苷質(zhì)量濃度為10.94mg／mL。此時模型預(yù)測的最大響應(yīng)值即濃縮度為2.2993。為了證實(shí)模型的預(yù)測值與實(shí)測值之間的擬合程度，在上述2因子的取值處進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，其響應(yīng)量結(jié)果為2.282±0.066（N＝3，P＝95%），預(yù)測值與試驗(yàn)值之間具有良好的擬合性，表明了模型的有效性。

表10 中心組合試驗(yàn)方差分析

經(jīng)響應(yīng)面分析獲得的納濾膜濃縮純化樹莓色素的優(yōu)化條件如下：溫度為30℃、壓力為0.6MPa、進(jìn)料花色苷質(zhì)量濃度為10.94mg／L、pH 為3.12。

在最佳條件下納濾樹莓色素溶液，截留率為98.26%，色素溶液的花色苷質(zhì)量濃度由10.94mg／L提高到38.24mg／L。由此可見，截留分子量為300道爾頓的納濾膜對樹莓色素的截留效果很好，具有良好的濃縮和純化作用。

pH和進(jìn)料質(zhì)量濃度對納濾效果影響的響應(yīng)面圖如圖2所示。

圖2 pH和進(jìn)料質(zhì)量濃度對納濾效果影響的響應(yīng)面圖

2.3 紅樹莓色素納濾濃縮動態(tài)試驗(yàn)

為了研究納濾效果隨時間的變化，設(shè)計小型動態(tài)試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。動態(tài)試驗(yàn)的進(jìn)料體積為1500mL，納濾時間為33min，每3min測1次截留液的吸光度，并計算濃縮度。納濾條件為：溫度30℃，壓力0.6MPa，pH3.12，進(jìn)料花色苷質(zhì)量濃度為10.94mg／L。

圖3 納濾濃縮動態(tài)試驗(yàn)

由圖3可知，濃縮度隨納濾時間的延長逐漸增大，進(jìn)料體積為1500mL時，納濾30min濃縮度為3.981，接近最大值3.996。而且通過試驗(yàn)得知，由于納濾過程采用的是不加水循環(huán)方式，進(jìn)料體積直接影響納濾時間的長短，從而影響納濾效果。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

通過本研究可見，納濾對紅樹莓色素具有很好的濃縮純化效果。紅樹莓色素屬于花色苷類物質(zhì)，對溫度及pH等條件變化均比較敏感，這使得此類色素在提取后加工過程中會遇到一些穩(wěn)定性問題，而納濾工藝條件均能滿足利于花色苷色素穩(wěn)定的條件，所以納濾是花色苷類色素很好的濃縮方法。

很多學(xué)者在研究納濾方法的應(yīng)用方面，采用膜通量來衡量納濾效果[14－16]，而本研究中采用濃縮度衡量紅樹莓色素納濾濃縮效果，是基于以下兩點(diǎn)考慮。其一，本試驗(yàn)重點(diǎn)研究納濾能否成功運(yùn)用于紅樹莓色素乃至花色苷類色素的濃縮純化，而非考察膜的工作性質(zhì)；其二，隨著納濾的進(jìn)行，膜通量隨納濾時間延長而下降，同時，有少量花色苷會透過納濾膜，導(dǎo)致膜通量不能很好的反映濃縮的效果。本研究在以濃縮度為指標(biāo)考察納濾效果的同時，考察了膜對紅樹莓色素截留率，發(fā)現(xiàn)，截留率在95%～98%區(qū)間，也說明納濾膜可以很好的對紅樹莓色素進(jìn)行濃縮純化。

納濾是一個動態(tài)過程，本研究中采用不加水循環(huán)式納濾，料液的體積大小直接影響到納濾的效果，料液體積大，達(dá)到相同的濃縮效果，需要的時間則長；同時隨著納濾的進(jìn)行，膜開始污染，膜通量下降，納濾濃縮的效果會受到一定的影響，因此，在納濾運(yùn)用到花色苷類色素濃縮純化的具體應(yīng)用時，還應(yīng)該考慮到料液體積及膜的清潔程度等因素的影響。

3.2 結(jié)論

紅樹莓色素納濾濃縮純化法的最佳工藝條件為，納濾溫度為30℃，壓力為0.6MPa，進(jìn)料花色苷質(zhì)量濃度為 10.94mg／L，pH 為 3.12。色 素 截 留 率 為98.26%。動態(tài)試驗(yàn)表明，紅樹莓色素納濾濃縮度可達(dá)3.996。納濾法濃縮純化為紅樹莓色素提取后加工提供了便捷穩(wěn)定可行的方法。

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