響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化超臨界CO2抗溶劑法制備負(fù)載β-胡蘿卜素的玉米蛋白納米粒

孫麗君，林長春，趙翔宇，趙亞平,*

(1.上海交通大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，上海 200240；2.江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化超臨界CO2抗溶劑法制備負(fù)載β-胡蘿卜素的玉米蛋白納米粒

孫麗君1，林長春1，趙翔宇2，趙亞平1,*

(1.上海交通大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，上海 200240；2.江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

利用響應(yīng)面設(shè)計(jì)對超臨界CO2抗溶劑法制備負(fù)載β-胡蘿卜素的玉米蛋白納米粒的工藝進(jìn)行研究。分別以β-胡蘿卜素的負(fù)載量和包埋率為優(yōu)化指標(biāo)，系統(tǒng)考察芯材比、溫度、壓力等主要因素對玉米蛋白包埋β-胡蘿卜素的交互影響，采用SEM、DLS和XRD對產(chǎn)品形貌、粒徑和結(jié)構(gòu)等進(jìn)行表征。結(jié)果表明：芯材比對載藥量和包埋率的影響最顯著，其次是壓力，最后是溫度。當(dāng)芯材比1:10(質(zhì)量比)、溫度55℃、壓力8MPa時(shí)，β-胡蘿卜素的負(fù)載量達(dá)到最大值8.73%；當(dāng)芯材比1:30、溫度35℃、壓力16MPa時(shí)，β-胡蘿卜素的包埋率有最高值85.4%。玉米蛋白和β-胡蘿卜素形成Matrix結(jié)構(gòu)，顆粒平均粒徑大約150nm，粒徑分布窄，球形度好。

超臨界二氧化碳；β-胡蘿卜素；玉米蛋白；響應(yīng)面法

β-胡蘿卜素是一種廣泛存在于植物和果實(shí)中的脂溶性營養(yǎng)成分[1]，具有多種生理功能，它的抗氧化活性可以保護(hù)機(jī)體組織免受氧自由基的毒害，具有預(yù)防癌癥、預(yù)防心血管疾病、抗輻射、提高機(jī)體免疫力等保健功能[2]。由于β-胡蘿卜素不溶于水，對光、空氣敏感，極易氧化而降低其生物活性，在實(shí)際應(yīng)用中受到限制[3]。為此，人們直接將β-胡蘿卜素微粉化以提高在水中的分散性，或者與生物相容性聚合物混合制成微粒，以提高β-胡蘿卜素的生物利用度和穩(wěn)定性，其中氣流粉碎、噴霧干燥、重結(jié)晶(溶劑蒸發(fā)或液體抗溶劑)是常用方法。但是，這些技術(shù)存在很多缺點(diǎn)，或者易導(dǎo)致β-胡蘿卜素分解，有機(jī)溶劑污染，或者產(chǎn)品粒子粒徑很大，分布尺度很寬。與傳統(tǒng)微粉化技術(shù)相比，以CO2為抗溶劑的超臨界流體抗溶劑技術(shù)(supercritical fluid anti-solvent，SAS)，特別適合微粉化熱敏感、易氧化的物質(zhì)，該技術(shù)具有反應(yīng)條件溫和、工藝簡單、產(chǎn)品粒徑小、尺度可控、低溶劑殘留等優(yōu)點(diǎn)[4-6]。

玉米蛋白是從玉米中提取出來的醇溶性谷蛋白，是生物相容性和生物可降解性良好的藥物載體材料。玉米蛋白作為載體材料，已包埋過伊維菌素[7-8]、胰島素[9-10]、環(huán)丙沙星[11]、溶菌酶[12-13]等藥品，表現(xiàn)出良好的緩釋性能，抗胃蛋白酶分解性，是良好的腸溶性包衣材料。

本實(shí)驗(yàn)以β-胡蘿卜素為模型藥物，玉米蛋白為包埋材料，采用超臨界二氧化碳抗溶劑技術(shù)制備負(fù)載β-胡蘿卜素的玉米蛋白納米粒。考察芯材比、溫度、壓力、溶液流速等多因素對負(fù)載β-胡蘿卜素的玉米蛋白納米粒的形成，載藥量和包埋率的影響。本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面法[14-15]對各主要因素及交互作用進(jìn)行系統(tǒng)研究，以獲得最佳制備條件。分別采用掃描電鏡(scanning electron microscope，SEM)、粒度分析儀(dynamic light scattering，DLS)、X射線衍射(X-ray diffractomer，XRD)對產(chǎn)品形貌，粒徑大小結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了表征。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米蛋白(食品級) 上?；巧锟萍加邢薰?；β-胡蘿卜素(純度≥97.5%) 北京伊普瑞斯科技有限公司；乙醇、二氯甲烷(分析純) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；二氧化碳(工業(yè)級，含量≥99.5%) 上海瑞利化工氣體有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004型電子分析天平 上海天平儀器廠；SP-756型紫外-可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；800B型超聲儀 上海安亭科學(xué)儀器廠；HJ-4A型攪拌器金壇市杰瑞爾電器有限公司；AXS型X射線粉末衍射儀德國Bruker公司；JSM-7401型掃描電子顯微鏡 日本電子株式會社；SFE121-50-01型超臨界萃取裝置 南通華興石油儀器有限公司；ZS-90型納米粒度儀 英國馬爾文儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

圖1 SAS過程設(shè)備流程圖Fig.1 Schematic digram of SAS appatus

實(shí)驗(yàn)過程，先設(shè)定熱交換器4和空氣浴5的溫度，到預(yù)定溫度后，用高壓柱塞泵3將CO2泵入到沉淀釜。待壓力達(dá)到設(shè)定值，保持CO2的泵入速率，打開放氣閥，建立動態(tài)平衡體系，保持釜內(nèi)壓力恒定。高效液相泵7以恒定速率將溶液打入沉淀釜6，溶液與CO2經(jīng)同軸噴嘴進(jìn)入釜腔，溶劑擴(kuò)散并溶解于超臨界CO2中，同時(shí)CO2擴(kuò)散進(jìn)入溶劑中使溶劑膨脹，原溶液中的β-胡蘿卜素和玉米蛋白達(dá)到過飽和沉析出來，并收集于釜底過濾板上。打完溶液后，停止高效液相泵7，繼續(xù)用高壓柱塞泵3泵入CO230min，以去除殘留的有機(jī)溶劑。最后，停止高壓柱塞泵，緩慢泄壓至釜內(nèi)壓力降為大氣壓，打開釜腔，收集分析過濾板上的樣品。

1.3.2 β-胡蘿卜素負(fù)載量的測試

利用紫外-分光光度法測試并計(jì)算β-胡蘿卜素質(zhì)量。具體步驟如下：稱取5.0mg樣品，置于25.0mL容量瓶中，二氯甲烷乙醇混合溶劑(體積比9:5)超聲溶解，使負(fù)載的β-胡蘿卜素充分溶解，利用SP-752PC型紫外-可見分光光度計(jì)測試。并計(jì)算β-胡蘿卜素負(fù)載量。

1.3.3 β-胡蘿卜素包埋率的測試

β-胡蘿卜素在樣品中有兩種存在方式，包埋在納米粒中，或附著在納米粒表面。正己烷能溶解一定量的β-胡蘿卜素，而不溶解玉米蛋白，因此用正己烷清洗附著在納米粒表面的β-胡蘿卜素，以計(jì)算包埋率。具體步驟如下：稱取5.0mg樣品于5mL離心管中，加入正己烷，劇烈震蕩后，在10000r/min的轉(zhuǎn)速下離心，取上清液至25.0mL容量瓶中定容，用紫外分光光度計(jì)測試。β-胡蘿卜素的包埋率計(jì)算公式如下：

β-胡蘿卜素包埋率/%=

1.3.4 SEM分析

將少許樣品顆粒粘在導(dǎo)電膠上，真空狀態(tài)下噴金4min，噴金厚度約為250A，然后采用SEM對樣品進(jìn)行觀察分析。

1.3.5 DLS分析

稱取樣品5.0mg，用20mL去離子水分散，超聲1min，用納米粒度儀測定粒徑大小。

1.3.6 XRD分析

通過X射線粉末衍射儀，考察樣品處理后結(jié)晶度的變化。采用Cu靶(Cu-Kα)，石墨單色濾波器，連續(xù)掃描，電壓40kV，電流30.0mA，2θ：5～60°，速度10°/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

稱取一定量的玉米蛋白和β-胡蘿卜素溶解于二氯甲烷和乙醇的混合溶劑中(體積比為9:5)，超臨界CO2流速為4kg/h，根據(jù)本課題組的前期研究[16]，實(shí)驗(yàn)選取芯材比、溫度、壓力3個(gè)主效因子作為響應(yīng)面試驗(yàn)的因素，β-胡蘿卜素的負(fù)載量和包埋率作為響應(yīng)值。各個(gè)因素的水平選擇范圍為芯材比1:10～1:30、溫度35～55℃、壓力8～16MPa。響應(yīng)面各因素及水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels in response surface design

優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析采用響應(yīng)面法中的Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，利用Design-Expert 7.1.6軟件設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面法試驗(yàn)，共有17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中12個(gè)為析因點(diǎn)，5個(gè)為零點(diǎn)以估計(jì)誤差，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)值結(jié)果Table 2 Box-Behnken matrix design scheme and response values

2.2 方差分析

2.2.1 β-胡蘿卜素負(fù)載量

利用軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到模型的二次多項(xiàng)回歸方程為：

Y1=2.40200-1.79250A＋0.74000B-1.19750C-0.46250AB＋1.30250AC-0.57250BC＋0.56275A2＋0.077750B2＋0.052750C2(1)

表3 方差分析Table 3 Variance analysis for the established regreesion model for β-carotene loading

由表3可知，失擬項(xiàng)不顯著(P=0.4730＞0.05)，模型的P值為0.0003，表明模型極顯著。從表3中可以看出因素一次項(xiàng)A、B、C、交互項(xiàng)AC對試驗(yàn)的影響極顯著。同時(shí)軟件方程的決定系數(shù)R2=0.9648，表明該模型擬合程度良好，該模型是合適的。在所選取的因素水平范圍內(nèi)，因素對結(jié)果的影響排序?yàn)樾静谋龋緣毫Γ緶囟取?/p>

壓力和芯材比對載藥量(Y1)的響應(yīng)面如圖2所示，由于響應(yīng)面的最大值出現(xiàn)在設(shè)計(jì)范圍的邊緣，根據(jù)二次多項(xiàng)式(1)給出的信息，對β-胡蘿卜素負(fù)載量進(jìn)行預(yù)測，在芯材比1:10、溫度55℃、壓力8MPa時(shí)，載藥量可以達(dá)到9.16%。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到β-胡蘿卜素負(fù)載量為8.73%。說明模型可靠。

圖2 壓力和芯材比對β-胡蘿卜素負(fù)載量的影響Fig.2 Resposne surface plot for the interative effects of pressure and core/wall ratio onβ-carotene loading

2.2.2 β-胡蘿卜素包埋率

根據(jù)Design-Expert 7.1.6軟件所做的分析，得到二次擬合回歸方程：

決定系數(shù)R2=0.9154，表明該模型可以較好的解釋β-胡蘿卜素包埋率的變化。根據(jù)上面的方程繪制的壓力和芯材比對包埋率的Y2響應(yīng)面分析如圖3所示。結(jié)合方程和響應(yīng)面分析圖可知，β-胡蘿卜素包埋率的最大值點(diǎn)出現(xiàn)在邊緣，由二次擬合回歸方程(2)可預(yù)測當(dāng)反應(yīng)條件為芯材比1:30、溫度35℃、壓力16MPa，最大包埋率可達(dá)84.3%。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，在此工藝條件下β-胡蘿卜素的包埋率達(dá)到85.4%。

圖3 壓力和芯材比對β-胡蘿卜素包埋率的影響Fig.3 Resposne surface plot for the interative effects of pressure and core/wall ratio onβ-carotene embeded rate

2.3 負(fù)載β-胡蘿卜素的玉米蛋白納米粒表征

2.3.1 形貌及粒徑分析

圖4 負(fù)載β-胡蘿卜素的玉米蛋白納米粒SEM圖(a)和粒徑大小分布圖(b)Fig.4 SEM image and particle size distribution

圖4 是負(fù)載β-胡蘿卜素的玉米蛋白納米粒(反應(yīng)條件為芯材比1:10、溫度55℃、壓力12MPa)的SEM照片和粒徑大小分布圖。由圖4a可見，產(chǎn)品呈均勻的球形顆粒，粒徑在100～200nm之間，顆粒之間稍有團(tuán)聚。納米粒度儀對樣品的測試結(jié)果如圖4b所示，樣品的平均粒徑在150nm左右，粒徑分布窄，與SEM的測試結(jié)果相似。

2.3.2XRD分析

β-胡蘿卜素、玉米蛋白納米粒、β-胡蘿卜素與玉米蛋白物理混合顆粒以及抗溶劑法制備的負(fù)載β-胡蘿卜素玉米蛋白納米粒的XRD分析如圖5所示，由此可以看出，β-胡蘿卜素在2θ為10～25°有很強(qiáng)的特征衍射峰(圖5a)；單獨(dú)的玉米蛋白納米粒(圖5b)微球沒有顯示特征衍射峰，只有兩個(gè)軟物質(zhì)的寬峰；對比圖5c和圖5d可以看出，物理混合與抗溶劑法制備的β-胡蘿卜素和玉米蛋白復(fù)合物中，β-胡蘿卜素的存在形式是不一樣的，微球物理混合的(圖5c)特征衍射峰比較明顯，說明物理混合沒有改變β-胡蘿卜素的晶型，或者β-胡蘿卜素沒有被玉米蛋白完全包封，而在超臨界二氧化碳抗溶劑法制備的負(fù)載β-胡蘿卜素的玉米蛋白納米粒中，β-胡蘿卜素的特征衍射峰大部分消失了，這可能是超臨界二氧化碳抗溶劑過程導(dǎo)致β-胡蘿卜素的結(jié)晶度下降，造成了特征峰的消失，同時(shí)也可能是β-胡蘿卜素被玉米蛋白完全包封了，其特征峰無法顯現(xiàn)。

圖5 XRD衍射圖譜Fig.5 XRD spectra image

3 結(jié) 論

3.1 采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化SAS法制備負(fù)載β-胡蘿卜素的玉米蛋白復(fù)合物納米粒，確定了影響載藥量和包埋率的主要因素及最優(yōu)工藝條件。芯材比對載藥量和包埋率的影響最顯著，其次是壓力，最后是溫度。當(dāng)芯材比1:10、溫度55℃、壓力8MPa時(shí)，β-胡蘿卜素的負(fù)載量達(dá)到最大值8.73%；當(dāng)芯材比1:30、溫度35℃、壓力16MPa時(shí)，β-胡蘿卜素的包埋率達(dá)到最高值85.4%。

3.2 制備的負(fù)載β-胡蘿卜素的玉米蛋白納米粒呈均勻球形，顆粒粒徑分布在100～200nm之間；β-胡蘿卜素在物理混合的樣品與抗溶劑法制備的樣品中的存在形式有較大差異。

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Optimizing Supercritical Anti-solvent Preparation of β-carotene-loaded Zein Nanospheres by Response Surface Methodology

SUN Li-jun1，LIN Chang-chun1，ZHAO Xiang-yu2，ZHAO Ya-ping1,*
(1. School of Chemistry and Chemical Engineering, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China；2. School of Chemistry and Material Engineering, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Response surface methodology was used to optimize the preparation of β-carotene-loaded zein nanospheres by supercritical anti-solvent technique. The effects of the ratio between β-carotene and zein, temperature, and pressure as well as interactions among them on β-carotene loading and embedding rate were investigated, and the morphology, particle size and structure of β-carotene-loaded zein nanospheres were characterized by SEM, DLS and XRD. The results indicated that core/wall ratio had the most significant effect on β-carotene loading and embedding rate, sequentially followed by pressure and temperature. β-carotene loading reached its maximum level of 8.73%, when the β-carotene/zein ratio was 1:10, the temperature 55 ℃, and the pressure 8 MPa. β-carotene showed a maximum embedded rate of 85.4% under the following conditions: β-carotene/zein ratio of 1:30, temperature of 35 ℃, and pressure of 16 MPa. The structure of β-carotene-loaded zein particles was a matrix, the average particle size was about 150 nm with a narrow distribution, and the spherical degree was high.

supercritical CO2；β-carotene；zein；response surface methodology

TQ460.62

A

1002-6630(2011)08-0019-05

2010-07-17

國家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA10Z350)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20976103)

孫麗君(1984—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槌R界二氧化碳制備納米營養(yǎng)物。E-mail：lijunsun2008@sjtu.edu.cn

*通信作者：趙亞平(1962—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槌R界流體在化學(xué)、化工過程中的應(yīng)用。E-mail：ypzhao@sjtu.edu.cn