超臨界CO2狀態(tài)下直接酯化法制備共軛亞油酸甘油酯

李默馨，劉 晶，周曉丹，高宇薇，于殿宇*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

超臨界CO2狀態(tài)下直接酯化法制備共軛亞油酸甘油酯

李默馨，劉 晶，周曉丹，高宇薇，于殿宇*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

在超臨界CO2狀態(tài)下，采用脂肪酶催化共軛亞油酸(conjugated linoleic acid，CLA)與甘油反應(yīng)制備共軛亞油酸甘油酯，分別應(yīng)用單因素和正交試驗(yàn)考察分子篩添加量、酶用量、反應(yīng)壓力、溫度和時(shí)間對(duì)CLA酯化率的影響。結(jié)果表明，最佳工藝條件為分子篩用量6%、酶用量4%、反應(yīng)溫度60℃、反應(yīng)時(shí)間20h、反應(yīng)壓力11MPa，此條件下CLA的酯化率可達(dá)到90.98%。這種CLA甘油酯的脂肪酸組成中，9c,11t-CLA和10t,12c-CLA的含量分別為37.79%和41.66%。

超臨界CO2；共軛亞油酸；甘油酯；CLA酯化率

共扼亞油酸(conjugated linoleic acid，CLA)是亞油酸的一組位置和幾何異構(gòu)體的通稱，科學(xué)證實(shí)9c,11t-CLA和10t,12c-CLA具有抑制腫瘤、抗動(dòng)脈粥樣硬化、降低生物體脂肪等生理活性[1-2]。天然的共軛亞油酸主要存在于瘤胃動(dòng)物牛、羊等的乳汁和肉制品中，但含量很少[3]，鑒于CLA的這些生理功能，人們一直期望在膳食中含有一定量CLA的同時(shí)提高其吸收率。但CLA以游離酸的形式存在時(shí)，易氧化，口感不好，且不易被身體吸收[4-5]，因此制備CLA的甘油酯產(chǎn)品，具有廣闊的應(yīng)用前景。

CLA甘油酯產(chǎn)品的獲得主要有化學(xué)法和酶法兩種。傳統(tǒng)應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工等行業(yè)的甘油酯產(chǎn)品主要是采用化學(xué)法催化油脂甘油制得的[6]，但此法存在著反應(yīng)溫度高、化學(xué)污染嚴(yán)重、產(chǎn)物色澤差等缺點(diǎn)；目前，國內(nèi)外多以酶催化法合成，該法在有機(jī)溶劑和無溶劑中反應(yīng)都取得了較好進(jìn)展，但在超臨界二氧化碳(SC-CO2)狀態(tài)酶法催化合成CLA甘油酯尚未見相關(guān)報(bào)道。SC-CO2狀態(tài)下酶反應(yīng)，是近年來生物工程新開拓的領(lǐng)域[7]。當(dāng)CO2達(dá)到臨界溫度(31.1℃)和壓力(7.28MPa)以上時(shí)，CO2顯示出較大的溶解能力和較高傳遞特性，從而可大大降低酶反應(yīng)過程的傳質(zhì)阻力，提高酶反應(yīng)速率[8]；另外，SC-CO2無毒、不可燃、化學(xué)惰性佳、易與反應(yīng)物底物分離[9]。這些優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)使其在食品工業(yè)上的應(yīng)用具有廣闊的發(fā)展前景。本實(shí)驗(yàn)以CLA和甘油為原料，對(duì)超臨界狀態(tài)下酶法合成CLA甘油酯進(jìn)行研究，探討反應(yīng)壓力、溫度、時(shí)間、底物物質(zhì)的量比、分子篩添加量和酶用量對(duì)酯化率的影響，為工業(yè)生產(chǎn)中有效獲得CLA甘油酯提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

共軛亞油酸(80%) 青島澳海有限公司；CLA標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司；Novozym 435脂肪酶(酶活1340U/g)丹麥若維信公司；甲醇(色譜純)、甘油(分析純)、正己烷(色譜純)、氫氧化鉀(分析純)、3A分子篩 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SHA-CA水浴恒溫振蕩器 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；高壓反應(yīng)釜 江蘇太倉市醫(yī)療器械廠；7890A氣相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司；高速離心機(jī) 北京醫(yī)藥公司；XW-80A微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠；AR2140電子精密天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶促酯化的方法

在反應(yīng)釜中按3:1的物質(zhì)的量的比加入CLA與甘油，同時(shí)加入轉(zhuǎn)子和一定量的脂肪酶、分子篩，將反應(yīng)釜密封后充入少量CO2以置換出反應(yīng)釜中的空氣，同時(shí)試漏，確定反應(yīng)釜密封情況良好后，在加壓泵的作用下充入CO2使反應(yīng)釜內(nèi)達(dá)到一定壓力，然后將反應(yīng)釜置于水浴鍋中，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速至100r/min，在一定溫度下反應(yīng)一定時(shí)間。

1.3.2CLA的測(cè)定與分析

取1.3.1節(jié)中液體產(chǎn)物3～5滴，稱質(zhì)量，采用無水硫酸鈉過濾除去水分，以體積分?jǐn)?shù)1% H2SO4-甲醇甲酯化[10]后溶于正己烷，供氣相色譜分析。CLA的含量通過利用CLA標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線算出。

氣相色譜分析方法參考Eulitz等[11]的方法。

1.4CLA酯化率計(jì)算

式中：C0為反應(yīng)初始體系中CLA的單位含量(g/g)；Ct為反應(yīng)完畢后體系的游離CLA的單位含量(g/g)。

1.5 甘油酯的純化

反應(yīng)完畢后，取出轉(zhuǎn)子，將反應(yīng)釜內(nèi)的物質(zhì)在高速離心機(jī)的作用下離心除去固定化脂肪酶、分子篩和水。取上述物質(zhì)溶于正己烷中，加入酚酞指示劑，用0.1mol/L KOH-乙醇滴定，直至出現(xiàn)粉紅色。加水洗分層，取上層旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去殘存的溶劑[12]，得到共軛亞油酸甘油酯。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)條件對(duì)CLA酯化率的影響

2.1.1 分子篩添加量對(duì)CLA酯化率的影響

分子篩添加量分別為2%、4%、6%、8%和10% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))時(shí)，酶用量2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、反應(yīng)壓力8MPa、反應(yīng)溫度50℃、反應(yīng)時(shí)間15h，分子篩添加量對(duì)CLA酯化率的影響見圖1。

圖1 分子篩添加量對(duì)CLA酯化率的影響Fig.1 Effect of type 3A molecular sieve amount on CLA esterification

由圖1可知，分子篩添加量對(duì)CLA酯化率的影響較顯著。CLA酯化率隨著分子篩添加量的增加而提高，這主要是由于CLA與甘油反應(yīng)的副產(chǎn)物水分子能夠及時(shí)被分子篩吸收，反應(yīng)才能夠持續(xù)向正向進(jìn)行。當(dāng)分子篩添加量達(dá)到6%時(shí)，CLA的酯化率為69.37%，分子篩用量繼續(xù)增加時(shí)，CLA酯化率的提高并不顯著，反而有下降的趨勢(shì)。這可能是由于酶反應(yīng)主要在環(huán)繞著酶分子的水層內(nèi)進(jìn)行，底物分子必須先進(jìn)入微水相，才能與酶作用，激發(fā)酶的活性[13]，當(dāng)分子篩添加量過高時(shí)，體系中的水分子被分子篩吸收的過多，反而不利于酶反應(yīng)的進(jìn)行。因此分子篩添加量為6%較為適宜。

2.1.2 酶用量對(duì)CLA酯化率的影響

酶用量分別取1%、2%、3%、4%和5%時(shí)，分子篩添加量6%、反應(yīng)壓力8MPa、反應(yīng)溫度50℃、反應(yīng)時(shí)間15h，酶用量對(duì)CLA酯化率的影響見圖2。

圖2 酶用量對(duì)CLA酯化率的影響Fig.2 Effect of Novozym 435 lipase on CLA esterification

在超臨界高壓下，脂肪酶活力基本不受影響[14]。隨著酶用量的增加CLA的酯化率也隨之提高，但當(dāng)酶用量達(dá)到3%以上時(shí)，CLA酯化率的增加趨勢(shì)并不明顯，這可能是由于酶用量過高時(shí)催化反應(yīng)速率加快，分子篩用量相對(duì)不足，不能吸收產(chǎn)生的水分子，導(dǎo)致反應(yīng)不能及時(shí)向正向進(jìn)行。同時(shí)脂肪酶價(jià)格較高，出于成本考慮，酶用量選擇3%最為適宜。

2.1.3 反應(yīng)壓力對(duì)CLA酯化率的影響

反應(yīng)壓力分別取8、9、10、11、12MPa時(shí)，分子篩添加量6%、酶用量3%、反應(yīng)溫度50℃、反應(yīng)時(shí)間15h，反應(yīng)壓力對(duì)CLA酯化率的影響見圖3。

圖3 反應(yīng)壓力對(duì)CLA酯化率的影響Fig.3 Effect of pressure on CLA esterification

由圖3可知，壓力對(duì)脂肪酶本身體系影響不大，主要是它影響了SC-CO2的性質(zhì)，從而影響反應(yīng)速率及酯化率[15]。一般隨著反應(yīng)壓力的增加，反應(yīng)速率加快，從而可相應(yīng)縮短反應(yīng)時(shí)間，當(dāng)壓力達(dá)到11MPa以上時(shí)，CLA酯化率的提高并不明顯，因此反應(yīng)壓力11MPa較為適宜。

2.1.4 反應(yīng)溫度對(duì)CLA酯化率的影響

反應(yīng)溫度分別取40、50、60、70、80℃時(shí)，分子篩添加量6%、酶用量3%、反應(yīng)壓力11MPa、反應(yīng)時(shí)間15h，反應(yīng)溫度對(duì)CLA酯化率的影響見圖4。

圖4 反應(yīng)溫度對(duì)CLA酯化率的影響Fig.4 Effect of temperature on CLA esterification

由圖4可知，當(dāng)溫度從40℃升至60℃時(shí)，CLA的酯化率隨之逐漸上升，這說明隨著溫度的升高脂肪酶的催化活性部位逐漸暴露，發(fā)揮出較強(qiáng)的活性。當(dāng)溫度達(dá)到60℃時(shí)，脂肪酶催化活性達(dá)到極值，之后酯化程度開始下降，這有可能是由于較高溫度致使酶部分失活而引起的?？梢?，Novozym 435在催化酯化反應(yīng)的最佳溫度在60℃左右。

2.1.5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)CLA酯化率的影響

反應(yīng)時(shí)間分別取5、15、25、35、45h時(shí)，分子篩添加量6%、酶用量3%、反應(yīng)壓力11MPa、反應(yīng)溫度60℃，反應(yīng)時(shí)間對(duì)CLA酯化率的影響見圖5。

圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)CLA酯化率的影響Fig.5 Effect of reaction time on CLA esterification

催化酯化反應(yīng)過程中，Novozym 435通常所需時(shí)間較長，多在24～48h，但反應(yīng)時(shí)間過長會(huì)直接影響酶的活力和重復(fù)利用。由圖5可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，CLA的酯化率不斷提高，但當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到25h后上升效果并不顯著，這是因?yàn)殡S著反應(yīng)時(shí)間延長，底物濃度和酶活力開始降低，反應(yīng)速度逐漸減小，酯化率的增長趨于平緩，體系基本達(dá)到平衡。綜合考慮反應(yīng)時(shí)間以25h為宜。

2.2 最佳工藝參數(shù)的確定

表1 CLA酯化反應(yīng)正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal array design

表2 CLA酯化反應(yīng)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Scheme and experimental result of orthogonal array design

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，保持反應(yīng)壓力11MPa，選擇分子篩用量、酶用量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)(每一組合中安排了3次重復(fù)試驗(yàn))，從而優(yōu)化超臨界CO2狀態(tài)下酶法合成CLA甘油酯的反應(yīng)條件。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis for CLA esterification

由表2極差分析結(jié)果可知，各因素對(duì)CLA酯化率影響的主次順序?yàn)榉肿雍Y添加量＞酶用量＞反應(yīng)溫度＞反應(yīng)時(shí)間。由正交試驗(yàn)結(jié)果的直觀分析可知，最優(yōu)組合為A2B3C2D1，即反應(yīng)條件為分子篩添加量6%、酶用量4%、反應(yīng)溫度60℃、反應(yīng)時(shí)間20h。

由表3方差分析結(jié)果可知，A因素在α=0.1水平顯著，D因素SS值相對(duì)較小，可作為誤差項(xiàng)，由于沒有交互作用，故為加性模型，即A、B與C的好水平組合表現(xiàn)一定好，因而可由直觀分析判斷有A2B3C2參加的處理表現(xiàn)一定好于其他處理。

由于正交試驗(yàn)中無此組合，因最佳提取工藝不包含在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表內(nèi)，為了進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)論的準(zhǔn)確性，進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。結(jié)果證明此條件下CLA的酯化率可達(dá)到90.98%。

2.3 共軛亞油酸的GC分析

圖6 CLA標(biāo)準(zhǔn)品的GC圖Fig.6 GC chromatography of CLA standard

圖7 CLA甘油酯的GC圖Fig.7 GC chromatography of CLA glyceride

CLA標(biāo)準(zhǔn)品、CLA甘油酯中脂肪酸組成情況的GC分析結(jié)果如圖6、7。

由圖6可知，在CLA標(biāo)準(zhǔn)品中，具有生理活性的CLA異構(gòu)體，即9c,11t-CLA和10t,12c-CLA的含量分別為49.34%和48.74%，保留時(shí)間分別為46.803min和47.316min。在反應(yīng)產(chǎn)物的GC圖(圖7)中，9c,11t-CLA和10t,12c-CLA分別在46.818min和47.342min時(shí)出現(xiàn)，含量分別為37.79%和41.66%，即反應(yīng)產(chǎn)物的脂肪酸組成中，具有生理活性的脂肪酸含量高達(dá)79.45%。

3 結(jié) 論

在超臨界CO2狀態(tài)下酶法制備CLA甘油酯，通過單因素和正交試驗(yàn)的研究，確定最佳的制備工藝：分子篩添加量6%、酶用量4%、反應(yīng)溫度60℃、反應(yīng)時(shí)間20h、反應(yīng)壓力11MPa，結(jié)果表明，此條件下CLA的酯化率可達(dá)到90.98%。CLA甘油酯的脂肪酸組成中，9c,11t-CLA和10t,12c-CLA的含量分別為37.79%和41.66%。此方法產(chǎn)生的CLA甘油酯屬天然，綠色的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)，能夠滿足特殊人群對(duì)CLA的需求。

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Preparation of Conjugated Linoleic Acid Glyceride by Direct Esterification under Supercritical Carbon Dioxide

LI Mo-xin，LIU Jing，ZHOU Xiao-dan，GAO Yu-wei，YU Dian-yu*
(College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

The lipase-catalyzed preparation of conjugated linoleic acid glyceride (CLA) from conjugated linoleic acid and glycerin under supercritical CO2was studied. The effects of the quantities of molecular sieve and enzyme addition, pressure, temperature and time on the esterification rate of CLA were investigated. The results showed that the optimal parameters for preparing CLA were as follows: in the attendance of 6% type 3A molecular sieve and 4% Novozym 435 lipase, reaction at 60 ℃ and 11 MPa for 20 h. Under these conditions, the esterification rate of CLA reached 90.98%. The contents of 9c,11t-CLA and 10t,12c-CLA was 37.79% and 41.66%, respectively in the CLA glyceride prepared.

supercritical CO2；conjugated linoleic acid (CLA)；glyceride；esterification rate of CLA

TS229

A

1002-6630(2011)08-0029-04

2010-10-17

國家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2010AA101503)

李默馨(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。E-mail：moxin89152936@163.com

*通信作者：于殿宇(1964—)，男，教授，碩士，研究方向?yàn)榇蠖辜庸ぜ夹g(shù)。E-mail：dyyu2000@yahoo.com.cn