昆明系小鼠生物法定量測定水產(chǎn)品中河豚毒素

王 靜，楊麗君*，李兆杰**，趙 萌，宋曉華，劉玉敏

昆明系小鼠生物法定量測定水產(chǎn)品中河豚毒素

王 靜，楊麗君*，李兆杰**，趙 萌，宋曉華，劉玉敏

(威海出入境檢驗檢疫局，山東 威海 264205)

為建立昆明系小鼠定量測定河豚毒素(TTX)方法，選用體質量19～21g的昆明系小鼠作為實驗對象，用不同質量濃度TTX溶液腹腔注射小鼠。結果顯示：TTX致昆明系小鼠的半數(shù)致死量(LD50)為0.18μg，小鼠死亡時間與TTX注射劑量滿足方程Y=e(0.357/X＋1.005)。此外，采用體積分數(shù)0.5%乙酸溶液提取TTX，回收率達到90%以上，對樣品的最低檢測限為0.56μg/g。昆明系小鼠定量測定河豚毒素，準確、穩(wěn)定、方便快捷，可用于水產(chǎn)品安全檢測。

河豚毒素；半數(shù)致死劑量(LD50)；昆明系小鼠；提取

河豚毒素(tetrodotoxin，TTX)是普遍存在于河豚魚及其他生物體內的一種生物堿，它是自然界中毒性最強的非蛋白類神經(jīng)毒素之一[1]。河豚魚味道鮮美，營養(yǎng)豐富，日本、中國等亞洲國家的居民素有食用的習慣，但因TTX化學性質相當穩(wěn)定，日曬、鹽腌及一般烹飪手段均難以破壞，中毒后也缺乏有效的解救措施，故TTX中毒事件屢有發(fā)生，嚴重威脅人們的生命安全。

為了控制TTX中毒事件的發(fā)生，各國有關部門均采取了嚴格的管理措施，我國《水產(chǎn)品衛(wèi)生管理法》雖然嚴格規(guī)定了河豚魚的銷售，但TTX中毒的現(xiàn)象時有發(fā)生。因此提高食用河豚魚質量安全水平，不僅要加強安全監(jiān)管，更重要的是不斷完善基層的快速、定量檢測TTX的方法。

目前，對TTX的檢測方法有多種，如小鼠生物檢測法、薄層色譜法、電泳法、酶聯(lián)免疫法、柱后衍生液相色譜熒光檢測法、氣相色譜-質譜聯(lián)用法、固相萃取-超過濾-液相色譜/質譜連用法、LC-MS聯(lián)用法等[2-6]。色譜法及免疫法等方法雖然檢測精度高，但操作繁瑣，儀器價格昂貴，耗費大，一般多用于科研方面研究應用，不適于生產(chǎn)一線及流通過程中的快速檢測。小鼠生物法是日本官方檢測TTX的生物學方法[7-8]，具有直觀、快速、癥狀典型、易于操作、費用低，而檢測精度能滿足水產(chǎn)品安全監(jiān)測要求等特點，也被國際上廣泛采用。

小鼠生物法的基本原理是TTX注射劑量與小鼠死亡時間倒數(shù)存在確定關系[9]，因此，可根據(jù)小鼠死亡時間來推斷體內TTX含量。目前小鼠生物法國際上大都采用ddy系小白鼠，臺灣學者試用ICR小鼠替代ddy小鼠，收到良好效果[10]。但目前國內尚無ddy系小鼠飼養(yǎng)點，ICR小鼠飼養(yǎng)點極少，本研究選用常見的昆明系小鼠(19～21g)作為試驗動物，進行TTX定量檢測方法研究，建立從提取到檢測、系統(tǒng)的昆明系小鼠定量測定TTX方法，為水產(chǎn)品生產(chǎn)企業(yè)及檢驗機構快速準確的檢測TTX，控制水產(chǎn)品質量安全，提供一定的參考依據(jù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

河豚肌肉組織取自威海某公司養(yǎng)殖東方紅鰭豚，養(yǎng)殖環(huán)境受控，為無河豚毒素河豚；體質量為19～21g的雄性昆明系小鼠購自煙臺綠葉制藥有限公司實驗動物中心，飼養(yǎng)參照GB 14925—2001《實驗動物環(huán)境及設施》進行。

TTX標準品(純度≥99%) 昆明科翔生物科技有限公司，于4℃保存。

TTX標準溶液：向1mg TTX干粉標準品中加入10mL體積分數(shù)為 0.1%的乙酸，溶解混勻，配制成100μg/mL母液。用微量移液器吸取100μg/mL母液1mL于100mL容量瓶中，加入0.1%乙酸溶液定容至100mL，即得到1.0μg/mL的標準溶液。以此標準溶液和0.1%乙酸溶液配制0.65～0.25μg/mL的梯度溶液，相鄰質量濃度差為0.05μg/mL。

1.2 儀器與設備

CR22GⅢ離心機 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠有效死亡的判定

用1mL注射器(配5號針頭)，分別抽取1mL不同質量濃度的TTX溶液，對小鼠進行腹腔注射。當TTX溶液完全注入小鼠腹腔時開始計時，如果注射時有1滴以上TTX溶液從小鼠腹內溢出，則判定小鼠死亡時間無效。

小鼠TTX中毒的典型癥狀為初期呼吸困難，急促，腹部收縮加快，反應遲鈍，繼而出現(xiàn)突然疾走，急跑急跳，四處亂竄，東倒西歪，翻轉亂跳等掙扎動作，數(shù)十秒后，小鼠后腿劇烈抽搐，2～3次后爬臥不動，腹部呼吸逐漸微弱減慢，最后死亡。以停止呼吸作為判斷死亡的標準。

1.3.2 TTX對昆明系小鼠半數(shù)致死量(LD50)的測定

將19～21g的昆明系小鼠隨機分為4組，每組10只，配制TTX質量濃度為0.15、0.171、0.195、0.221μg/mL。給每組小鼠腹腔注射不同質量濃度的TTX溶液，每只注射1mL，記錄小鼠死亡數(shù)量，用Bliss法，利用計算機BL-410程序計算得出TTX對昆明系小鼠的半數(shù)致死量(LD50)。

1.3.3 TTX劑量與小鼠死亡時間的關系

隨機將昆明系小鼠分成9組，每組10只，體質量在19～21g。每組分別腹腔注射TTX質量濃度為0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.60、0.65 μg/mL，每鼠注射1mL。記錄每組小鼠的死亡時間，采用Microsoft Excel 2003軟件，以TTX注射劑量為x軸，小鼠死亡時間為y軸，將有效數(shù)據(jù)作散點圖。根據(jù)散點圖，采用SPSS 11.0軟件，將TTX注射劑量(X)和小鼠死亡時間(Y)采用曲線估計法中的S模型得出兩者之間的經(jīng)驗方程。

1.3.4 經(jīng)驗方程的驗證

取0.4μg/mL與0.6μg/mL兩種不同質量濃度的TTX溶液，用相同方法腹腔注射小鼠，每個濃度注射15只小鼠并獲得10個有效數(shù)據(jù)，取其平均值，將所得平均值分別代入經(jīng)驗方程，推算注射劑量；再根據(jù)劑量計算出TTX質量濃度，與0.4μg/mL和0.6μg/mL兩個標準質量濃度相比，計算測定誤差。

1.3.5 TTX提取方法回收率的測定

取不含TTX的河豚肌肉組織，勻漿器勻漿，稱取10g于50mL離心管中，加入100μg/mL TTX 125μL(即12.5μg TTX)，攪拌混勻，使TTX充分吸附。然后加入0.5%乙酸溶液11mL，充分混勻，沸水浴中煮沸10min，期間加以攪拌防止組織結塊，沸后冷卻至室溫，20000×g離心20min，移取上清液于一干凈50mL離心管中，另向沉淀中加入0.5%乙酸溶液11mL，充分混勻，沸水浴中煮沸5min，沸后冷卻至室溫，20000 ×g離心20min，取上清液，將兩次離心上清液合并混勻，用0.5%乙酸定容至25mL。將此提取液腹腔注射小鼠，共注射10只，每只注射1mL，記錄小鼠死亡時間，根據(jù)TTX劑量-小鼠死亡時間關系曲線及經(jīng)驗方程，計算提取液中TTX含量，與加入TTX標準品劑量相比，求出此提取方法的回收率。

1.3.6 昆明系小鼠測定TTX的最低檢測限

取不含TTX的河豚肌肉組織，勻漿器勻漿，分別稱取10g于4個不同的50mL離心管中，向其中各加入100μg/mL TTX 50、55.6、69.4、83.3μL，攪拌混勻，使TTX充分吸附。然后提取各個樣品中的TTX，方法同上，最后將各提取液用0.5%乙酸分別定容至25mL。將此提取液腹腔注射小鼠，每個提取液注射10只，每只注射1mL，同時注射0.18、0.20、0.25、0.30μg/mL的標準TTX溶液作對照。同時以提取液作為空白對照注射10只小白鼠。記錄每組小鼠死亡只數(shù)和死亡時間，據(jù)此判斷昆明系小鼠測定TTX的最低檢測限。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 11.0軟件。

2 結果與分析

2.1 TTX對昆明系小鼠半數(shù)致死量(LD50)的測定

通過對體質量19～21g的昆明系小鼠注射不同劑量的TTX，應用Bliss法測得TTX對昆明系小鼠半數(shù)致死量LD50及95%的可信限分別為0.18μg和0.171～0.190 μg/mL(表1)。

表1 TTX對昆明小鼠半數(shù)致死量的測定Table 1 LD50determination of TTX for Kunming strain mice

2.2 TTX劑量與小鼠死亡時間的關系

以注射劑量為自變量(X)，小鼠死亡時間為因變量(Y)，得出注射劑量與小鼠死亡時間呈自然指數(shù)關系(圖1)，符合曲線Y=e(0.357/X＋1.005)，R2=0.992。

圖1 TTX劑量-昆明系小鼠死亡時間關系曲線Fig.1 Curves of TTX dosage against mean death time of Kunming mice

2.3 方法驗證結果

根據(jù)2.2節(jié)中注射劑量與小鼠死亡時間的自然指數(shù)關系方程，得出擬合曲線表達式：

式中：X為TTX注射劑量/μg；Y為昆明系小鼠死亡時間/min。

將昆明系小鼠的死亡時間代入曲線方程，從而計算得到TTX劑量，即得TTX質量濃度。各取10個有效數(shù)據(jù)的平均數(shù)，分別為6.75min和4.95min，代入曲線方程，得出TTX質量濃度分別為0.394μg/mL和0.601μg/mL，取兩位有效數(shù)字，即為0.39μg/mL和0.60μg/mL，與加入標準品質量濃度極為接近，符合性極好。

2.4 TTX提取方法回收率的測定

應用0.5%乙酸溶液煮沸并高速離心法提取TTX，可以使TTX的回收率大大提高，達到(90.4±3.7)%。實驗結果見表2。

表2 TTX回收率實驗結果Table 2 Recovery rates for TTX

2.5 昆明系小鼠測定TTX的最低檢測限

向無毒河豚肌肉組織中添加不同劑量的TTX，使肌肉組織TTX含量分別為0.50、0.56、0.69、0.83μg/g。考慮90%左右的提取方法回收率，初步估計對應TTX提取液的質量濃度分別約為0.18、0.20、0.25、0.30μg/mL。根據(jù)實驗觀測，注射提取液空白對照的10只小鼠均未死亡，注射0.18μg/mL TTX提取液，小鼠僅有部分死亡(6只)，而注射0.20、0.25、0.30μg/mL TTX提取液，小鼠全部死亡，且死亡時間與注射等質量濃度標準品相當。表明0.20μg TTX為昆明系小鼠的最低檢測量，與此相對應，此法對樣品的最低檢測限為0.56μg/g。

3 討 論

3.1 TTX對昆明系小鼠的LD50的分析

在實際毒素檢測過程中，通常用鼠單位的方法表示毒素的濃度。根據(jù)鼠單位(MU)的定義，1MU指采用腹腔注射的方式，30min內殺死1只20g體質量的雄性ddy小鼠的毒素量[7,10]，目前國際通用的鼠單位為日本學者測定的ddy系小鼠(1鼠單位=0.22μg TTX)。但因敏感性的不同，不同品系1MU所表示的TTX含量不同。Huang[10]以LD50作為1MU。TTX對臺灣ICR小鼠的LD50為0.178μg，對日本ddy小鼠的LD50為0.22μg，張理等[11]研究得出TTX對北京ICR小鼠的LD50為0.159μg，對昆明系小鼠的LD50為0.165μg，華元渝等[12]研究得出TTX對ICR小鼠的LD50為0.1836μg，由此可見即使是同一品系小鼠，LD50也有差異，究其原因，可能存在異地實驗或是TTX純度不同等某些影響因素。而本實驗得出TTX對昆明系小鼠的LD50為0.18μgTTX，較張理等[11]得出的LD50(0.165μg)稍高。

3.2 TTX注射劑量與昆明系小鼠死亡時間的曲線關系

許多研究表明，TTX注射劑量與小鼠死亡時間之間存在明顯的曲線關系[9,12-14]。根據(jù)此規(guī)律國內有諸多采用ICR系或昆明系小鼠進行TTX檢測方法的研究，但尚存在很多問題，如應用其他品系小鼠檢測TTX，但卻等同采用ddy系小鼠死亡時間與小鼠單位(MU)換算表，因不同品系對TTX的敏感性不同，故等同采用可能會產(chǎn)生較大誤差；或是根據(jù)在一定注射劑量范圍內TTX劑量與小鼠死亡時間倒數(shù)存在直線關系這一規(guī)律，由小鼠死亡時間推算TTX質量濃度，但這僅僅局限于TTX在一定劑量范圍內，超出或低于此劑量便不適用。本實驗得出了TTX注射劑量與昆明系小鼠死亡時間的自然指數(shù)關系，符合經(jīng)驗方程Y=e(0.357/X+1.005)，且方法驗證結果表明，采用此公式計算TTX質量濃度，誤差很小，符合性非常好，此公式真正揭示了TTX致昆明系小鼠的死亡規(guī)律，對應用昆明系小鼠定量測定TTX更具有指導意義。

3.3 河豚毒素提取方法的改進

采用0.5%乙酸煮沸高速離心提取方法進行TTX的回收測定。結果顯示用此法提取TTX，回收率可達(90.4± 3.7)%，這較其他文獻報道的如0.1%乙酸提取法[7]，乙酸酸化甲醇提取法[15]等都高，分析其原因，可能有以下幾點：一是高濃度的乙酸可能有助于TTX的溶出；二是兩次煮沸使TTX溶出更完全；三是高速離心使TTX損失更少。另外，離心法取代了傳統(tǒng)的過濾法，可以大大加快樣品的制備速度。傳統(tǒng)的過濾法需要用較多的乙酸反復沖洗，易導致提取液體積的增加，擴大樣品的稀釋倍數(shù)，對于低毒組織的毒力測定非常不利。筆者通過實驗驗證還發(fā)現(xiàn)，應用乙酸酸化的甲醇法提取，存在一個嚴重問題：甲醇和乙酸會發(fā)生反應產(chǎn)生乙酸甲酯，而乙酸甲酯是一種有毒物質，會干擾結果的準確性。因此，應用0.5%乙酸煮沸高速離心的方法提取河豚毒素，更準確、更快速、更有效，為水產(chǎn)品生產(chǎn)企業(yè)及檢測機構嚴格控制水產(chǎn)品安全提供了可靠的方法指導。

3.4 昆明系小鼠測定TTX的最低檢測限

本實驗采用方法對TTX的最低檢測量0.20μg TTX，對樣品的最低檢測限為0.56μg/g。日本官方規(guī)定TTX含量小于10MU(ddy小鼠10個單位，相當于2.2μg/g)即可視為對人無毒，可以安全食用。2.2μg/g比本實驗的毒素最低檢測限0.56μg/g大了近4倍，反映出改進后的小鼠生物法的安全性和可靠性。

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Quantitative Detection of Tetrodotoxin Using Kunming Strain Mice

WANG Jing，YANG Li-jun*，LI Zhao-jie**，ZHAO Meng，SONG Xiao-hua，LIU Yu-min
(Weihai Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Weihai 264205, China)

This study was aimed at establishing a laboratory method for the quantitative detection of tetrodotoxin (TTX). A bioassay was developed by injecting intraperitoneally TTX at various dosages to Kunming strain male mice with body weights of 19-21 g. Results indicated that the 50% lethal dose (LD50) of TTX for Kunming strain mice was 0.18μg. The relationship between TTX dosage and the mean death time of Kunming mice could be expressed as Y = e(0.357/X+1.005). In addition, a high recovery rate of TTX was achieved by using 0.5% (V/V) acetic acid to extract TTX from globefish, which reached up to 90%. However, the detection limit of the assay for samples was 0.56μg/g. Therefore, Kunming strain mice can be used to quantitatively determine TTX in an accurate, stable and convenient manner, which is promising in the safety control of fishery products.

tetrodotoxin；50% lethal dose (LD50)；Kunming strain mouse；extraction

R155.5；TS254.1

A

1002-6630(2011)04-0181-04

2010-04-14

2009年國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局出入境檢驗檢疫行業(yè)標準制(修)訂計劃項目(2009B138)

王靜(1975—)，女，工程師，學士，主要從事微生物學和海洋毒素研究。E-mail：wangjing7548@sohu.com

*并列第一作者：楊麗君(1969—)，女，工程師，學士，主要從事微生物學和海洋毒素研究。E-mail：whylj2000@yahoo.com.cn

**通信作者：李兆杰(1981—)，男，工程師，博士，主要從事海洋生物學、微生物學及海洋生物技術研究。

E-mail：hunterlee_81@163.com