杜衡揮發(fā)油微波輔助提取及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析

李 超，王乃馨，鄭 義，嚴(yán)茂飛，李姣姣

杜衡揮發(fā)油微波輔助提取及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析

李 超，王乃馨，鄭 義，嚴(yán)茂飛，李姣姣

(徐州工程學(xué)院食品工程學(xué)院，江蘇 徐州 221008)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)對(duì)杜衡揮發(fā)油微波提取工藝中的液料比、微波功率和微波時(shí)間3因素進(jìn)行研究，分析各因素與得率的關(guān)系，得出優(yōu)化組合，并建立數(shù)學(xué)模型。結(jié)果表明：最佳的工藝條件為液料比(mL/g)8.3:1、微波功率309W、微波時(shí)間154s；在此條件下做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得出杜衡揮發(fā)油得率7.96%，與理論值7.90%基本一致，說(shuō)明回歸模型能較好地預(yù)測(cè)杜衡揮發(fā)油提取得率。采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)杜衡揮發(fā)油成分進(jìn)行分離鑒定，分離出25種成分，共確認(rèn)了其中19種，采用峰面積歸一化法確定了各成分的相對(duì)含量。本方法可為杜衡的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用提供參考。

微波輔助提??；杜衡；揮發(fā)油；響應(yīng)曲面法；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

杜衡(Asarum forbesii Maxim.)為馬兜鈴科細(xì)辛屬植物杜衡的根莖及草或全草，又名馬辛、南細(xì)辛、馬蹄香、馬蹄細(xì)辛，為多年生草本植物，產(chǎn)于江蘇、安徽、浙江、江西、河南南部、湖北及四川東部。本品全草入藥，具有驅(qū)風(fēng)逐寒、消痰引水、活血平喘、定痛等作用[1]。杜衡主要有效成分為揮發(fā)油，其常用提取方法有水蒸氣蒸餾法、熱回流提取等，都存在提取時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)。微波輔助提取作為一種優(yōu)良的提取方法，具有操作簡(jiǎn)便快捷、提取時(shí)間短及提出率高等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用在生物活性物質(zhì)的提取方面[2-9]。運(yùn)用微波輔助提取杜衡揮發(fā)油的工藝及其成分分析未見(jiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上運(yùn)用響應(yīng)曲面法研究微波輔助提取其揮發(fā)油的最佳工藝參數(shù)，同時(shí)通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)揮發(fā)油成分進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杜衡 安徽亳州市三義堂藥業(yè)有限責(zé)任公司。石油醚(30～60℃)、乙醚、正己烷、乙酸乙酯和無(wú)水Na2SO4皆為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩 浙江上虞華美儀器紗篩廠；風(fēng)選中藥粉碎機(jī) 山東省青州市精誠(chéng)機(jī)械制造有限公司；FA2104N電子分析天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；SENCO R201L旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海申生科技有限公司；XMT-152電熱恒溫干燥箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；CW-2000型超聲-微波協(xié)同萃取儀 上海新拓分析儀器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 微波提取

杜衡粉碎后過(guò)80目篩，精確稱(chēng)取約5g置于100mL特制三角瓶中，加入一定體積的提取劑后，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)提取一定時(shí)間后，在提取液加入無(wú)水Na2SO4后過(guò)濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后稱(chēng)量。根據(jù)CW-2000型超聲-微波協(xié)同萃取儀的特點(diǎn)，提取時(shí)將超聲波處于關(guān)閉狀態(tài)。

1.3.2 工藝優(yōu)化設(shè)計(jì)

1.3.2.1 單因素試驗(yàn)

分別以提取劑種類(lèi)、液料比、微波功率和微波時(shí)間為影響因素考察其對(duì)得率的影響。

1.3.2.2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取液料比、微波功率和微波時(shí)間3個(gè)影響因素，采用三因素三水平響應(yīng)曲面分析方法，因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。共15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中12個(gè)為析因點(diǎn)，3個(gè)為中心點(diǎn)。

表1 杜衡揮發(fā)油微波輔助提取Box-Behnken試驗(yàn)因素水平表Table 1 Coded variables and their coded levels in response surface analysis

設(shè)該模型通過(guò)最小二乘法擬合的二次多項(xiàng)方程為：

式中：EY為預(yù)測(cè)響應(yīng)值；xi和xj為自變量代碼值；β0為常數(shù)項(xiàng)，βi為線性系數(shù)，βij為交互項(xiàng)系數(shù)，βii為二次項(xiàng)系數(shù)，ε為隨機(jī)誤差。按照Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，對(duì)方程的各項(xiàng)回歸系數(shù)進(jìn)行回歸擬合。

1.3.3 得率的計(jì)算

1.4 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析條件

氣相色譜條件：色譜柱：HP-5(30m×0.25mm，0.25μm)；進(jìn)樣溫度260℃；升溫程序?yàn)槌跏紲囟?0℃保持1min，20℃/min升溫至100℃，10℃/min升溫至250℃，20℃/min升溫至290℃、保持5min。載氣He，流量為1.0mL/min，溶劑延遲時(shí)間：3min；分流比為50:1；進(jìn)樣量為0.2μL。

質(zhì)譜條件：EI離子源，離子源溫度230℃，電子能量70eV，質(zhì)量掃描范圍33～500u，接口溫度280℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取劑種類(lèi)的影響

為考察提取劑種類(lèi)對(duì)杜衡揮發(fā)油得率的影響，試驗(yàn)設(shè)定液料比6:1(mL/g)、微波功率200W和微波時(shí)間90s，在不同提取劑條件下對(duì)得率進(jìn)行研究，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 提取劑種類(lèi)對(duì)得率的影響Fig.1 Effect of different solvents on oil yield

作為提取杜衡揮發(fā)油的理想溶劑應(yīng)具有以下特性：對(duì)揮發(fā)油的溶解性好、選擇性好，性質(zhì)穩(wěn)定、價(jià)格低廉、來(lái)源廣泛。杜衡揮發(fā)油的提取屬于固-液萃取過(guò)程，提取效果主要由原料顆粒度和溶劑的性質(zhì)決定。從圖1可知，4種溶劑中出得率最高的為正己烷7.19%，同時(shí)注意到采用正己烷和乙酸乙酯的得率相差不大，但乙酸乙酯的價(jià)格卻是正己烷的二分之一。因此選擇乙酸乙酯作為杜衡揮發(fā)油的提取劑。

2.1.2 液料比的影響

為考察液料比對(duì)杜衡揮發(fā)油得率的影響，選擇乙酸乙酯作為提取劑，同時(shí)設(shè)定微波功率200W和微波時(shí)間90s，在不同液料比條件下對(duì)得率進(jìn)行研究，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，乙酸乙酯的增加，更有利于杜衡揮發(fā)油的溶出，這是因?yàn)槿軇┖驮祥g的濃度差越大，其提取效率就越高，目標(biāo)物質(zhì)就越容易溶出，然而在液料比增加到8:1之后，杜衡揮發(fā)油得率有下降的趨勢(shì)，這是因?yàn)楫?dāng)溶劑過(guò)大時(shí)，微波的能量對(duì)沉滯低層的杜衡顆粒的熱效應(yīng)(相同時(shí)間提供的熱量被提取劑吸收的比例增加)的強(qiáng)度減弱，影響提取的效果，同時(shí)會(huì)造成溶劑和能源的浪費(fèi)，并給后續(xù)的濃縮工作帶來(lái)困難。因此選擇液料比為8:1進(jìn)入后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 料液比對(duì)得率的影響Fig.2 Effect of liquid-to-solid ratio on oil yield

2.1.3 微波功率的影響

為考察微波功率對(duì)杜衡揮發(fā)油得率的影響，試驗(yàn)選擇乙酸乙酯作為提取劑，同時(shí)設(shè)定液料比8:1(mL/g)和微波時(shí)間90s，在不同微波功率的條件下對(duì)得率進(jìn)行研究，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 微波功率對(duì)得率的影響Fig.3 Effect of microwave power on oil yield

由圖3可知，隨著微波功率的增加，物質(zhì)的加熱程度也隨之增加，使杜衡揮發(fā)油能夠容易地被提取出來(lái)，即得率增加；在微波功率達(dá)到300W之后，杜衡揮發(fā)油得率有減少的趨勢(shì)，這可能是由于高微波功率的熱效應(yīng)導(dǎo)致杜衡揮發(fā)油分解或揮發(fā)所致[10]。因此選擇300W進(jìn)入后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.4 微波時(shí)間的影響

為考察微波時(shí)間對(duì)杜衡揮發(fā)油得率的影響，試驗(yàn)選擇乙酸乙酯作為提取劑，同時(shí)設(shè)定液料比8:1(mL/g)和微波功率300W，在不同微波功率的條件下對(duì)得率進(jìn)行研究，結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知，在微波時(shí)間為150s之前，杜衡揮發(fā)油不能充分轉(zhuǎn)移到溶液中，隨著微波時(shí)間的延長(zhǎng)，杜衡揮發(fā)油得率增加，在150s時(shí)達(dá)到峰值，之后，繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間，得率有所下降，這可能是因?yàn)殡S著微波時(shí)間的延長(zhǎng)，溫度急劇升高，導(dǎo)致杜衡揮發(fā)油分解或揮發(fā)所致[11-12]。因此150s為最佳微波時(shí)間。

圖4 微波時(shí)間對(duì)得率的影響Fig.4 Effect of microwave treatment time on oil yield

2.2 Box-Behnken試驗(yàn)

2.2.1 模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

表2 微波輔助提取杜衡揮發(fā)油Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design scheme and corresponding experimental results

表3 響應(yīng)曲面二次回歸方程模型方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance of the developed quadratic regression model

利用Design expert V7.0.0統(tǒng)計(jì)軟件通過(guò)逐步回歸對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到杜衡揮發(fā)油得率對(duì)以上三個(gè)因素的二次多項(xiàng)回歸模型為：

對(duì)該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可見(jiàn)，模型極顯著(P＜0.01)，失擬項(xiàng)(P＞0.05)不顯著以及R2Adj=0.9179和RSN(信噪比)為12.823≥4，可知回歸方程擬合度和可信度均很高，試驗(yàn)誤差較小，故可用此模型對(duì)微波提取杜衡揮發(fā)油的工藝結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。2.2.2響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化

根據(jù)回歸方程的響應(yīng)曲面圖，考察所擬合的響應(yīng)曲面的形狀，分析液料比、微波功率和微波時(shí)間對(duì)得率的影響。其響應(yīng)曲面及其等高線如圖5所示，3組圖直觀地反映了各因素對(duì)響應(yīng)值的影響。

圖5 各因素交互作用對(duì)得率影響的響應(yīng)面和等高線Fig.5 Response surface and contour plots for the effects of pairwise interactions of three operating parameters on volatile oil yield

等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。比較3組圖并結(jié)合表3中P值可知：模型的一次項(xiàng)x2(P＜0.05)和x3(P＜0.05)顯著、x1(P＞0.05)不顯著；交互項(xiàng)x1x2(P＜0.05)顯著，其他各交互項(xiàng)都不顯著；二次項(xiàng)x12(P＜0.05)顯著，其他二次項(xiàng)都極顯著，表明各影響因素對(duì)杜衡揮發(fā)油得率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

為進(jìn)一步確定最佳提取工藝參數(shù)，對(duì)所得方程進(jìn)行逐步回歸，刪除不顯著項(xiàng)，然后求一階偏導(dǎo)，并令其為0，可得最佳工藝參數(shù)為液料比8.3:1(mL/g)、微波功率309W和微波時(shí)間154s，此時(shí)杜衡揮發(fā)油得率為7.90%。

2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為檢驗(yàn)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化出的工藝參數(shù)提取3次，實(shí)際測(cè)得的平均得率為7.96%，與理論預(yù)測(cè)值相比，其相對(duì)誤差約為0.76%。因此，基于Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)所得的最佳工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

2.3 杜衡揮發(fā)油化學(xué)成分的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析

圖6 微波輔助提取杜衡揮發(fā)油的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析總離子流圖Fig.6 GC-MS total ion current chromatogram of volatile oil extraction from Asarum forbesii Maxim by optimized microwave-assisted method

表4 杜衡揮發(fā)油化學(xué)成分的分析結(jié)果Table 4 Chemical composition of volatile oil from Asarum forbesii Maxim

取最佳提取工藝參數(shù)下的杜衡揮發(fā)油適量按上述氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析條件，通過(guò)氣質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)杜衡揮發(fā)油化學(xué)成分進(jìn)行分析，各分離組分利用計(jì)算機(jī)譜庫(kù)(NIST 05)進(jìn)行檢索和有關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行人工譜圖解析，采用色譜峰面積歸一化法進(jìn)行相對(duì)定量[13-15]。從杜衡揮發(fā)油中共分離出25個(gè)峰，確定了其中的19種化合物，所鑒定成分占總揮發(fā)油的95.64%，經(jīng)氣相色譜面積歸一化法測(cè)定了各組分的相對(duì)含量，分析鑒定結(jié)果見(jiàn)圖6和表4。相對(duì)含量在1%以上的有9種化合物，占總化合物的89.85%，其中相對(duì)含量最高的是甲基丁香酚，占35.76%，其次是橄香素，占22.77%，居第三位的是細(xì)辛脂素，占12.78%。在已鑒定出的19種化合物與文獻(xiàn)[8-10]報(bào)道既有相似的地方也有一定的區(qū)別的，原因可能是原料產(chǎn)地不同也有可能是由提取方法不同造成的。

3 結(jié) 論

3.1 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上建立一個(gè)以杜衡揮發(fā)油提取得率為目標(biāo)值，以液料比、微波功率和微波時(shí)間為因素的數(shù)學(xué)模型，方差分析表明擬合較好。通過(guò)對(duì)回歸方程優(yōu)化計(jì)算，得到提取的最佳工藝條件為液料比8.3:1 (mL/g)、微波功率309W和微波時(shí)間154s。對(duì)所建立的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，在最優(yōu)條件下，得到杜衡揮發(fā)油得率為7.96%，與理論值7.90%基本一致。

3.2 從杜衡揮發(fā)油中共分離出25個(gè)峰，確定其中的19種化合物，所鑒定成分占總揮發(fā)油的95.64%，經(jīng)氣相色譜面積歸一化法測(cè)定各組分的相對(duì)百分含量，其中相對(duì)含量最高的是甲基丁香酚，占35.76%，其次是橄香素，占22.77%，居第3位的是細(xì)辛脂素占12.78%。

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Microwave-assisted Extraction and Gas Chromatography-Mass Spectrometry Analysis of Volatile Oil from Asarum forbesii Maxim

LI Chao，WANG Nai-xin，ZHENG YI，YAN Mao-fei，LI Jiao-jiao
(College of Food Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China)

The optimization of the extraction of volatile oil from Asarum forbesii Maxim with microwave assistance was studied through one-factor-at-a-time instigations followed by mathematical modeling for extraction efficiency as a response to liquid-tosolid ratio, microwave power and treatment time based on the principle of Box-Behnken experimental design and response surface analysis of model. Liquid-to-solid ratio of 8.3:1, microwave power of 309 W and treatment time of 154 s were found optimum for the extraction of volatile oil with ethyl acetate, which was selected out of four common organic solvents based on oil yield. Under these conditions, the experimental value of oil yield was 7.96%, substantially complying with the theoretical value. This indicates good reliability of the developed regression model in predicting oil yield. The volatile oil extracted by the optimized method was subjected to separation and identification on a gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) system. A total of 25 constituents were separated and 19 of them were identified and quantified by area normalization method. This study can provide useful references for the development and exploitation of Asarum forbesii Maxim.

microwave-assisted extraction；Asarum forbesii Maxim；volatile oil；response surface methodology；gas chromatography-mass spectrometry

TS224.4

A

1002-6630(2011)04-0121-05

2010-03-28

徐州工程學(xué)院青年項(xiàng)目(XKY2009121)

李超(1978—)，男，講師，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。E-mail：chaoge002@163.com