響應(yīng)面法對大豆胰蛋白酶抑制劑粗提工藝的優(yōu)化

梁雪華，朱秀清,2,*，鄭環(huán)宇,2，張智宇

響應(yīng)面法對大豆胰蛋白酶抑制劑粗提工藝的優(yōu)化

梁雪華1，朱秀清1,2,*，鄭環(huán)宇1,2，張智宇1

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.國家大豆工程技術(shù)研究中心，黑龍江 哈爾濱 150030)

目的：對大豆胰蛋白酶抑制劑粗提工藝進行優(yōu)化。方法：以提取液pH值、熱變性溫度和硫酸氨飽和度作為影響大豆胰蛋白酶抑制劑提取率的因素，通過單因素試驗選取因素與水平，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，在單因素試驗基礎(chǔ)上采用三因素三水平響應(yīng)面分析法，依據(jù)回歸分析確定各工藝條件的主要影響因素，以大豆胰蛋白酶抑制劑提取率為響應(yīng)值作響應(yīng)面分析。結(jié)果：胰蛋白酶抑制劑提取的最佳工藝條件為提取液pH5.1、熱變性溫度72.8℃、硫酸氨飽和度54.5%，在此條件下，胰蛋白酶抑制劑的提取率達到86%。結(jié)論：采用響應(yīng)面分析法可以對大豆胰蛋白酶抑制劑粗提工藝進行優(yōu)化。

大豆胰蛋白酶抑制劑；粗提；Box-Behnken中心組合試驗

胰蛋白酶抑制劑是大豆的主要抗?fàn)I養(yǎng)因子，是一種含氨基酸殘基72～197個范圍的多肽或蛋白質(zhì)[1]。目前從大豆中已分離出兩種類型的蛋白酶抑制劑：一種為Kunitz型蛋白酶抑制劑(KSTI)，相對分子質(zhì)量為2萬，分子內(nèi)有兩個二硫鍵；另一種為Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制劑(BBI)，由71個氨基酸組成的多肽，分子質(zhì)量7975D，分子內(nèi)有7個二硫鍵[2-3]。有研究發(fā)現(xiàn)，胰蛋白酶抑制劑有許多重要的功能，如胰蛋白酶抑制劑是一類天然的抗蟲物質(zhì)[4]，在生物的生理體系中具有重要的調(diào)節(jié)作用[5]，在腫瘤抑制方面也具有潛在的應(yīng)用價值；另有研究表明大豆中微量胰蛋白酶抑制劑對于糖尿病治療[6-7]，調(diào)節(jié)胰島素失調(diào)可能有一定效果[8]。胰蛋白酶抑制劑在大豆中含量較少，大約為2%，因此對胰蛋白酶抑制劑提取工藝優(yōu)化具有重要意義。

響應(yīng)面法(response surface methodology，RSM)采用多元二次回歸方程擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問題，在食品工業(yè)中已得到了廣泛應(yīng)用[9]。本實驗擬在單因素試驗基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法對大豆胰蛋白酶抑制劑的粗提工藝進行優(yōu)化，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

低溫脫脂豆粕 哈爾濱高科技有限公司；BAPNA、胰蛋白酶、胰蛋白酶抑制劑 美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

電子天平 北京賽利多斯儀器系統(tǒng)有限公司；TU-1901型雙光速紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；高速離心機；PHS-3C型酸度計；HH-8恒溫水浴鍋。

1.2 方法

1.2.1 大豆胰蛋白酶抑制劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

胰蛋白酶抑制劑反應(yīng)試管：分別加入0.4、0.8、1.2、1.4、1.6、1.8mL 0.01g/100mL胰蛋白酶抑制劑，用蒸餾水補至2mL，加40mg/100mL BAPNA溶液5mL，40mg/100mL胰蛋白酶溶液2mL，于37℃水浴中反應(yīng)10min后加入36%乙酸溶液1mL混勻，以終止反應(yīng)，過濾，用1cm吸收皿，與空白作對比，于波長410nm處測定吸光度。

空白反應(yīng)試管：分別加入0.4、0.8、1.2、1.4、1.6、1.8mL 0.01g/100mL胰蛋白酶抑制劑，用蒸餾水補至2mL，加40mg/100mL BAPNA溶液5mL，加入36%乙酸1mL混勻，加入40mg/100mL胰蛋白酶溶液2mL，于37℃水浴中反應(yīng)10min，用1cm吸收皿，于波長410nm處測定吸光度。

1.2.2 大豆胰蛋白酶抑制劑的粗提及活性測定

1.2.2.1 大豆胰蛋白酶抑制劑提取工藝流程

低溫豆粕經(jīng)粉碎過100目篩后稱取100g，加入400mL 100mmol/L硫酸抽提，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)至設(shè)計的pH值，抽提后放置過夜以除雜蛋白，室溫下5500×g離心40min，取上清液備用；將沉淀按照上述條件再抽提一次，合并兩次上清液。上清液按設(shè)計溫度熱變性處理10min，室溫5500×g離心40min，留上清液。調(diào)上清液的pH6.0，邊攪拌邊加入固體硫酸氨至35%飽和度，4℃下放置過夜，室溫5500×g離心30min，留上清液。調(diào)上清液的pH6.0，攪拌的同時加入固體硫酸銨至所設(shè)計的飽和度，4℃條件下放置120min，室溫5500×g離心30min留沉淀。沉淀用少量去離子水溶解，對溶液進行超濾(濾膜選擇分子質(zhì)量5000D的膜)除去小分子，超濾后即得胰蛋白酶抑制劑粗提物[10-13]。

1.2.2.2 大豆胰蛋白酶抑制劑活性測定

采用改良的Eriksson法[14-15]。

1.2.2.3 大豆胰蛋白酶抑制劑提取率計算

根據(jù)大豆胰蛋白酶抑制劑活性的測定方法可以得到大豆胰蛋白酶抑制劑含量與吸光度之間的關(guān)系，再由所得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線可以由吸光度計算出大豆胰蛋白酶抑制劑的含量。

1.2.3 影響提取工藝的單因素試驗

預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)提取液的pH值、熱變性溫度、硫酸銨飽和度3個因素對大豆胰蛋白酶抑制劑提取率的影響較大，且相互間存在交互作用。因此，采用上述工藝流程，pH值選擇范圍4～6.5、熱變性溫度50～100℃、硫酸銨飽和度45%～70%條件下進行試驗，以確定各因素對大豆胰蛋白酶抑制劑提取率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝試驗

以胰蛋白酶抑制劑提取液的pH值、熱變性溫度、硫酸氨飽和度3個因素作為參考對象，采用響應(yīng)面法分析并設(shè)計試驗，以獲得最佳工藝參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 胰蛋白酶抑制劑標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-299.12x＋3.0704，R2=0.999，擬合度好。

2.2 提取液pH值的確定

根據(jù)預(yù)試驗，在熱變性溫度70℃、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%條件下考察提取液pH值對胰蛋白酶抑制劑提取率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 提取液pH值對胰蛋白酶抑制劑提取率的影響Fig.1 Effect of extraction solvent pH on extraction efficiency of trypsin inhibitor

從圖1可以看出，當(dāng)提取液pH5.5時提取率有最大值，而當(dāng)pH＞5.5時提取率隨pH值的增加而急劇下降。蛋白質(zhì)分子中所含氨基酸種類數(shù)目、空間結(jié)構(gòu)以及所含其他解離基因的不同，故不同蛋白質(zhì)有不同的等電點(pI)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于等電點時，其溶解度、黏度、滲透壓、膨脹及電導(dǎo)能力均為最低值。研究發(fā)現(xiàn)：pI并不是常數(shù)，其在一定程度上決定于介質(zhì)中的離子組成。所以在下面的響應(yīng)面試驗設(shè)計中提取液pH值的水平選擇4.5～5.5。

2.3 熱變性溫度的確定

根據(jù)預(yù)試驗，在提取液pH5.5、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%條件下考察熱變性溫度對胰蛋白酶抑制劑提取率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 熱變性溫度對胰蛋白酶抑制劑提取率的影響Fig.2 Effect of thermal denaturation temperature on extraction efficiency of trypsin inhibitor

從圖2可以看出，大豆胰蛋白酶抑制劑提取率在溫度50～80℃范圍內(nèi)緩慢降低，而溫度超過80℃后大豆胰蛋白酶抑制劑提取率急劇下降。90℃后則又緩慢降低。鑒于此過程主要為除雜蛋白而又不讓抑制劑損失過多，所以在下面的響應(yīng)面試驗設(shè)計中溫度選擇60～80℃。

2.4 硫酸氨飽和度的確定

根據(jù)預(yù)試驗，在提取液pH5.5、熱變性溫度70℃條件下考察硫酸銨飽和度對胰蛋白酶抑制劑提取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 硫酸銨飽和度對胰蛋白酶抑制劑提取率的影響Fig.3 Effect of ammonium sulfate saturation on extraction efficiency of trypsin inhibitor

由圖3可以看出，隨著硫酸銨飽和度的不斷增加，大豆胰蛋白酶抑制劑提取率先增大后減小，并在硫酸銨飽和度為55%時達到峰值。鑒于投入和產(chǎn)出的關(guān)系，在響應(yīng)面試驗設(shè)計中硫酸銨飽和度選擇在50%～60%。

2.5 響應(yīng)面設(shè)計對工藝參數(shù)的優(yōu)化試驗

2.5.1 大豆胰蛋白酶抑制劑粗提工藝的試驗設(shè)計

根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，綜合單因素試驗結(jié)果，選取提取液pH值、熱變性溫度、硫酸氨飽和度為對大豆胰蛋白酶抑制劑提取量影響較顯著的3個因素，采用三因素三水平響應(yīng)面分析方法，試驗以隨機次序進行，重復(fù)3次，因素與水平設(shè)計見表1，響應(yīng)面分析方案及試驗結(jié)果見表2。

表1 大豆胰蛋白酶抑制劑提取工藝響應(yīng)面試驗因素水平編碼表Table 1 Coded values and corresponding actual values of variables in response surface analysis

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Scheme and experimental results for response surface analysis

對表2在不同條件下所測得的大豆胰蛋白酶抑制劑提取率，利用Design Expert 7.1統(tǒng)計軟件進行回歸擬合，得到大豆胰蛋白酶抑制劑提取率(Y)的回歸方程：

2.5.2 模型方差分析

利用Design Expert 7.1統(tǒng)計軟件進行二次多元回歸擬合，得到回歸方程模型的方差分析和回歸方程系數(shù)估計值，見表3。

由表3可知，3個因素的P值相差較大，對提取結(jié)果的影響順序：熱變性溫度＞提取液pH值＞硫酸銨飽和度。從方差分析可以看出模型P＜0.01，表明該模型方程高度顯著，不同處理間的差異高度顯著。模型失擬項P=0.0758＞0.05，模型失擬項不顯著，模型選擇合適。由此可見，各具體試驗因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系。相關(guān)系數(shù)R2=1394.98/1448.53= 0.963＞0.8，說明提取率實際值與預(yù)測值之間具有較好的擬合度，因此該模型可用于預(yù)測響應(yīng)值大豆胰蛋白酶抑制劑提取率的實際情況。

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Analysis of variance of the regression equation for extraction efficiency of trypsin inhibitor

2.5.3 大豆胰蛋白酶抑制劑粗提率響應(yīng)面分析與最優(yōu)工藝條件的確定

通過得率回歸方程所作的降維分析見圖4、響應(yīng)面圖見圖5。由圖4可知，隨著各因素的增大，大豆胰蛋白酶抑制劑的提取率相應(yīng)的表現(xiàn)為先增大后降低，并在零水平附近達到最大值。蛋白質(zhì)的溶解性與溶液的pH值有直接的關(guān)系，當(dāng)溶液的pH值達到等電點時蛋白質(zhì)的溶解性隨著溶液的pH值的增大而減小，當(dāng)達到等電點時溶解度趨于最小，隨著溶液pH值的繼續(xù)增加蛋白質(zhì)的溶解度再度回升。大豆胰蛋白酶抑制劑的熱穩(wěn)定性與其結(jié)構(gòu)有關(guān)。KTI相對分子質(zhì)量21000，由181個氨基酸和2個二硫鍵組成。BBTI相對分子質(zhì)量約8000，由71個氨基酸和7個二硫鍵組成。KTI對熱和酸的抗性都弱于BBTI，這都與他們結(jié)構(gòu)上的差異有關(guān)。由此推斷到90℃時KTI已被部分或完全鈍化，而此時抑制劑還有活性說明還有一部分抑制劑存在，推測其剩余部分是BBTI。高濃度的鹽離子在蛋白質(zhì)溶液中可與蛋白質(zhì)競爭水分子，從而破壞蛋白質(zhì)表面的水化膜，降低其溶解度，使之從溶液中沉淀出來。各種蛋白質(zhì)的溶解度不同，因而可利用不同離子濃度的鹽溶液來沉淀不同的蛋白質(zhì)。由此可見，適當(dāng)?shù)脑龃蟾饕蛩刂悼梢栽谝欢ǔ潭壬咸岣咛崛÷?。因此，在實際操作中應(yīng)該對大豆胰蛋白酶抑制劑提取影響較大的因素慎重控制，以獲得較高的提取率。

大豆胰蛋白酶抑制劑提取率的響應(yīng)面趨勢呈拋物線形，因此回歸方程有極大值，結(jié)合方程與響應(yīng)曲面可得到大豆胰蛋白酶抑制劑粗提工藝的最優(yōu)參數(shù)為提取液pH5.1、熱變性溫度72.8℃、硫酸氨飽和度54.5%，在此條件下，大豆胰蛋白酶抑制劑的提取率達到86%。

圖4 各因素對考察指標(biāo)的降維分析圖Fig.4 Dimensionality reduction analysis of various process conditions

根據(jù)最佳工藝條件，做3組驗證實驗，結(jié)果大豆胰蛋白酶抑制劑提取率平均值為86%，與預(yù)測值接近。

圖5 各因素交互作用影響大豆胰蛋白酶抑制劑提取率的響應(yīng)曲面圖Fig.5 Response surface plots for the effects of pairwise interactions among various variables on extraction efficiency of trypsin inhibitor

3 結(jié) 論

通過單因素試驗及三因素三水平響應(yīng)面法試驗，建立響應(yīng)值與各因素之間的數(shù)學(xué)模型，依此模型可以預(yù)算理論提取率。用響應(yīng)面分析法對大豆胰蛋白酶抑制劑粗提的工藝參數(shù)進行優(yōu)化，得到的回歸方程：

對大豆胰蛋白酶抑制劑提取率影響較大的3個因素的P值相差較大，對提取結(jié)果的影響順序：熱變性溫度＞提取液pH值＞硫酸銨飽和度。根據(jù)回歸模型，確定大豆胰蛋白酶抑制劑粗提的最佳工藝參數(shù)：提取液pH5.1、熱變性溫度72.8℃、硫酸氨飽和度54.5%，大豆胰蛋白酶抑制劑的提取率達到86%。

[1]WOLFRAM B, ROBORT H. Natural protein proteinase inhibitors and their interaction with proteinaes[J]. Journal of Biochem, 1992, 204(2): 433-451.

[2]金蓓, 田少君. 大豆胰蛋白酶抑制劑研究概況[J]. 糧食與油脂, 2005 (6): 3-6.

[3]陳星, 劉蕾. 固定化酶法分離純化大豆胰蛋白酶抑制劑[J]. 食品科技, 2004(12): 12-15.

[4]朱新生, 朱玉賢. 抗蟲基因工程研究進展[J]. 植物學(xué)報, 1997, 39(3): 282-288.

[5]QI Ruifeng, SONG Zhanwu, CHI Chengwu. Structure features and molecular evolution of Bowman-Birk protease inhibitors and their potential application[J]. Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 2005, 37(5): 283-292.

[6]SHAPIRD J A M. Transplanting islets for diabetes[J]. the Scientist, 2006, 20(5): 42.

[7]LANZA A, TAVA A, CATALANO M, et a1. Effects of the Medicago scutellata trypsin inhibitor(MsTI) on cisplatin-induced cyto-toxicity in human breast and cervical cancer cells[J]. Anticancer Res, 2004, 24(1): 227-233.

[8]KENNEDY A R. The evidence for soybean products as cancer preventive agents[J]. The Journal of Nutrition, 1995, 125(3): 733-743.

[9]楊文雄, 高彥祥. 響應(yīng)面法及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J]. 中國食品添加劑, 2005(2): 68-71.

[10]王增祿, 茹炳根, 張英起, 等. 胰蛋白酶抑制劑親和層析柱的制備及豬胰臟中胰蛋白酶抑制劑的實驗研究[J]. 藥物生物技術(shù), 1996, 3(4): 197-201.

[11]嚴(yán)晴燕, 曹凱鳴. 大豆(G.max)胰蛋白酶抑制劑SBTi-A2新類型TiX的純化及其性質(zhì)研究[J]. 復(fù)旦學(xué)報: 自然科學(xué)版, 1996, 35(2): 150-156.

[12]廖海. 油菜胰蛋自酶抑制劑的分離純化與部分性質(zhì)研究[D]. 成都: 四川大學(xué), 2002.

[13]曾英, 桑玉英, 胡金勇, 等. 波葉青牛膽胰蛋白酶抑制劑的純化及其性質(zhì)研究[J]. 云南植物研究, 2002, 24(l): 103-108.

[14]陳志毅, 薛侃, 何天源. 血清中α1-AT抑制活力測定方法探討[J]. 蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 1988, 13(4): 259-262.

[15]ERIKSSON S. Studies inα1-antitrypsin deficiency[J]. Acta Med Scand, 1965, 432(Suppl1): 1-85.

Process Optimization for Trypsin Inhibitor Extraction from Defatted Soybean Meal by Response Surface Methodology

LIANG Xue-hua1，ZHU Xiu-qing1,2,*，ZHENG Huan-yu1,2，ZHANG Zhi-yu1
(1. College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China；2. National Research Center of Soybean Engineering and Technology, Harbin 150030, China)

Objective: The conditions for the extraction of trypsin inhibitor from low-temperature defatted soybean meal were optimized. Methods: pH, thermal denaturation temperature and ammonium sulfate saturation were identified to be main variables that influence extraction efficiency by the one-factor-at-a-time method. Based on the principles of Box-Behnken central composite design, response surface analysis was employed to explore the effects of pairwise interactions among the three variables at three levels on extraction efficiency. The optimum conditions for extracting soybean trypsin inhibitor from lowtemperature defatted soybean meal were found as follows: extraction solvent pH of 5.1, thermal denaturation at 72.8 ℃ and ammonium sulfate saturation of 54.5% for the precipitation of trypsin inhibitor. Under these conditions, the extraction efficiency of trypsin inhibitor was up to 86%. Consequently, response surface methodology is feasible for the optimization of the extraction process for trypsin inhibitor from defatted soybean meal, and the optimized process is reliable.

soybean trypsin inhibitor；extraction；Box-Behnken experimental design

TQ936.16

A

1002-6630(2011)04-0097-05

2010-04-15

國家“863”計劃項目(2006AA10Z322)

梁雪華(1983—)，男，碩士研究生，研究方向為大豆精深加工。E-mail：thelastbutnotleast@163.com

*通信作者：朱秀清(1968—)，女，研究員，碩士，研究方向為大豆精深加工。E-mail：xqzhuwang@163.com