納米銀體外抗腺病毒作用及機(jī)制研究

陳娜娜，王云華，尹儉儉，李秀景，鄭叢龍

(大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)教研室，遼寧 大連 116622)

腺病毒是一種無(wú)包膜DNA病毒，作為普通的機(jī)會(huì)性病原體長(zhǎng)期存在于人群中，具有很強(qiáng)傳染性。免疫功能低下的病人(如老年人、艾滋患者、免疫遺傳缺陷的患者、骨髓接受者、固體器官和造血干細(xì)胞移植者等)感染腺病毒的機(jī)率較大，在居住密集的人群，如軍隊(duì)人員中可引起急性發(fā)熱性呼吸道疾病的暴發(fā)流行[1]。腺病毒引起的急性傳染病，易侵犯呼吸道、眼結(jié)膜和淋巴結(jié)，主要表現(xiàn)為急性上呼吸道、眼部和胃腸道感染，腺病毒以其型別多、致病范圍廣而越來(lái)越受到關(guān)注，因此研發(fā)一種新的抗腺病毒藥物勢(shì)在必行。通過(guò)納米技術(shù)研制而成的納米銀(Silver nanoparticles,Silver-nps)，可以抵抗G+和G-細(xì)菌的感染，也可以對(duì)HIV、乙型肝炎病毒、呼吸道合胞病毒、猴痘病毒和單純皰疹病毒1型產(chǎn)生抑制作用[2]。但有關(guān)納米銀抗腺病毒作用及其機(jī)制研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本文應(yīng)用MTT法、免疫熒光技術(shù)、透射電鏡技術(shù)和PCR方法，探討納米銀抗腺病毒的作用及其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

腺病毒3型(ADV3)：由中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所提供，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室傳代保存；人宮頸癌(Hela)細(xì)胞：由本教研室傳代保存；RPMI 1640培養(yǎng)基：美國(guó)Gibco公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)： Sigma公司，美國(guó)；二甲亞砜(DMSO)：上海生工；免疫熒光試劑盒：Dako Cytomation,UK；LATaq酶，DL2000 maker,miniBEST RNA/DNA extraction Kit： TaKaRa公司，大連；納米銀溶液：由本課題研究組應(yīng)用化學(xué)還原法制得，溶液濃度為400 μg/mL，顆粒平均粒徑約為10 nm，納米銀溶液室溫保存6個(gè)月無(wú)沉積現(xiàn)象發(fā)生。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ADV3病毒毒力測(cè)定:用維持液將病毒做10倍系列稀釋?zhuān)渲频?0-1、10-2、10-3、10-4、10-55個(gè)不同濃度的病毒液，100 μL/孔分別加入已長(zhǎng)成單層Hela細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中，每個(gè)劑量設(shè)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照，置37℃，5%CO2孵箱，培養(yǎng)2 h后棄掉上述液體，更換細(xì)胞維持液100 μL/孔繼續(xù)培養(yǎng)，倒置顯微鏡下每日觀察，記錄細(xì)胞形態(tài)變化，連續(xù)觀察6 d，培養(yǎng)結(jié)束前4 h，吸棄培養(yǎng)板中液體,PBS沖洗3次,每孔加入MTT(5 mg/mL) 25 μL，于37℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h,去上清后每孔加DMSO(二甲亞砜)150 μL，微量振蕩器振蕩10 min,酶標(biāo)讀數(shù)儀(波長(zhǎng)492 nm)測(cè)吸光度(A)值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算ADV3的半數(shù)組織感染量(TCID50)。

1.2.2 納米銀細(xì)胞毒性測(cè)定:用細(xì)胞維持液將400 μg/mL納米銀溶液2倍系列稀釋?zhuān)吹茫?00、100、50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL 7個(gè)濃度的納米銀。100 μL/孔分別加入已長(zhǎng)成單層的Hela細(xì)胞96孔培養(yǎng)板中，每個(gè)劑量設(shè)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照，正常細(xì)胞對(duì)照,置37℃，5%CO2孵箱培養(yǎng)2 h后棄掉上述液體，更換細(xì)胞維持液100 μL/孔繼續(xù)培養(yǎng)，每日于倒置顯微鏡下觀察，記錄細(xì)胞形態(tài)變化，連續(xù)觀察6 d。計(jì)算納米銀的最大無(wú)毒濃度(TC0)，方法同上。

1.2.3 不同給藥方式下納米銀對(duì)ADV3的抑制作用:(1) 納米銀對(duì)病毒增殖的抑制作用(先ADV3后納米銀) 在長(zhǎng)成單層的HeLa細(xì)胞的96 孔板上，接種100 μL/孔的100TCID50腺病毒液，37℃ 吸附2 h，棄病毒液。在藥物無(wú)毒范圍內(nèi)加入含50 μg/mL納米銀的維持液，每孔100 μL，此濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照、ADV3對(duì)照和納米銀(50 μg/mL )對(duì)照，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。當(dāng)ADV3病毒對(duì)照組CPE達(dá)75% 以上，MTT 法檢測(cè)細(xì)胞存活率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次；(2) 對(duì)腺病毒侵入細(xì)胞的阻斷作用(先納米銀后ADV3)在藥物無(wú)毒范圍內(nèi)，預(yù)先加入含50 μg/mL納米銀維持液100 μL，作用2 h后用PBS 洗滌3次再加入100TCID50腺病毒,吸附2 h,棄病毒上清，加維持液100 μL，此濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔,其他同上；(3)對(duì)腺病毒直接滅活作用(ADV3和納米銀同時(shí)作用) 在藥物無(wú)毒范圍內(nèi),含50 μg/mL納米銀維持液分別與100TCID50腺病毒液等量混合,體外作用2 h后，立即加到已長(zhǎng)成單層HeLa細(xì)胞的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃ 吸附2 h 后，棄去96 孔板中液體，加入維持液100 μL，此濃度亦設(shè)5個(gè)復(fù)孔，其余同上。

1.2.4 免疫熒光法檢測(cè)納米銀對(duì)ADV3的抑制作用：待Hela細(xì)胞在置有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板上長(zhǎng)滿(mǎn)單層，將納米銀和腺病毒作如下處理后進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)：(1)先ADV3后納米銀組：預(yù)先加入100TCID50腺病毒液1 mL，吸附2 h后用PBS洗滌3次，再加入含50 μg/mL納米銀維持液1 mL/孔，吸附2 h后棄上清，加入維持液1 mL，置5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每日觀察CPE。實(shí)驗(yàn)中同時(shí)設(shè)正常Hela細(xì)胞對(duì)照、ADV3對(duì)照、溶劑與ADV3混合作用對(duì)照組；(2)先納米銀后ADV3組：預(yù)先加入的含50 μg/mL納米銀維持液1 mL，作用2 h后用PBS洗滌3次，再加入100TC ID50腺病毒1 mL，吸附2 h，棄病毒上清，其余同上；(3)ADV3和納米銀同時(shí)作用組：將含50 μg/mL納米銀維持液與100 TCID50腺病毒液等量充分混合，室溫作用2 h后，立即加入細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃吸附2 h后，棄去上清，其余同上。當(dāng)ADV3病毒對(duì)照組CPE達(dá)75%以上，取出各組蓋玻片用PBS洗3遍，用100%冷丙酮固定20～30 min，加screening reagent 30 μL于各個(gè)蓋玻片上，37℃作用30 min，取出用PBS沖洗3次，加anti - mouse- FITC 30 μL于各個(gè)蓋玻片上，作用37℃ 30 min，取下蓋玻片用PBS沖洗3遍，用濾紙吸干，加mounting fluid 1滴，封片，于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5 電鏡觀察不同時(shí)間納米銀對(duì)ADV3病毒粒子的破壞作用:將腺病毒液和等體積的400 μg/mL納米銀在室溫分別作用30 min、60 min、90 min、120 min、150 min后，用鑷子夾住銅網(wǎng)并浸沒(méi)于上述樣品中靜置10 min后，夾出已吸附樣品的銅網(wǎng)，將銅網(wǎng)浸沒(méi)于磷鎢酸染液(2%，pH=6.5)中靜置2～3 min，取出后用蒸餾水滴在銅網(wǎng)上1～2次，用濾紙吸去剩余水，干燥放置，透射電鏡觀察。

1.2.6 納米銀對(duì)ADV3核酸的作用：將病毒滴度>107的首次擴(kuò)增的腺病毒保存液，稀釋后接種于已長(zhǎng)成單層的HeLa 細(xì)胞中，37℃吸附2 h，加入維持液放于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞病變后于-20℃/37℃ 凍融3次收集病毒液。將等體積ddH2O，溶劑，50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL納米銀分別與等體積病毒液混合。于室溫作用2 h后，參照Takara miniBEST RNA/DNA extr action試劑盒提取腺病毒DNA，針對(duì)Hexon區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，Ad3F:GGTAGAGA TGCTG TTGCA GGA,Ad3R:CCCATCCATTAGTGTCATCG GT[3]。以94℃變性1 min，58℃退火50 s ，72℃延伸2 min，循環(huán)15次，以使其達(dá)到PCR的線性期，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 病毒毒力測(cè)定

采用Reed-Munch 法計(jì)算ADV3在HeLa細(xì)胞中的TCID50為10-2.74/100 μL，實(shí)驗(yàn)中病毒攻擊量為100TCID50/100 μL。

2.2 納米銀對(duì)HeLa細(xì)胞的毒性作用

納米銀對(duì)HeLa細(xì)胞的毒性表現(xiàn)為細(xì)胞顆粒較多、增殖緩慢、折光性強(qiáng)。納米銀對(duì)細(xì)胞的毒性作用隨著藥物濃度的降低而降低。MTT結(jié)果表明，納米銀對(duì)Hela細(xì)胞的最大無(wú)毒濃度(TC0) 為52.48 μg/mL。

2.3 不同給藥方式下納米銀對(duì)ADV3的抑制作用

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，先ADV3后納米銀組、先納米銀后ADV3組、ADV3與納米銀同時(shí)作用組細(xì)胞存活率分別與ADV3病毒對(duì)照組細(xì)胞存活率相比，差異具有顯著性意義(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 納米銀對(duì)ADV3的抑制作用

2.4 免疫熒光法檢測(cè)納米銀對(duì)ADV3的抑制作用

待Hela細(xì)胞在置有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板上長(zhǎng)滿(mǎn)單層，將納米銀和腺病毒作不同處理后封片，于熒光顯微鏡下觀察：先ADV3后納米銀組、先納米銀后ADV3組、ADV3和納米銀同時(shí)作用組的細(xì)胞特異性熒光很少見(jiàn)，細(xì)胞病變較輕，有一定回縮，但間隙不大，形態(tài)基本正常；溶劑混合ADV3組和ADV3對(duì)照組中，Hela細(xì)胞的胞漿和胞核中均出現(xiàn)了很強(qiáng)的特異性綠色熒光，出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變，細(xì)胞回縮變圓，間隙增大，相互融合成典型的葡萄串狀；正常Hela細(xì)胞中未見(jiàn)特異性綠色熒光，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常。見(jiàn)圖1。

圖1 免疫熒光法檢測(cè)納米銀對(duì)ADV3的抑制作用

A.先ADV3后納米銀；B.先納米銀后ADV3；C.ADV3和納米銀同時(shí)作用；D.溶劑混合ADV3；E.ADV3；F.正常Hela細(xì)胞

2.5 納米銀對(duì)ADV3病毒粒子的破壞作用

將納米銀和ADV3病毒液作用不同時(shí)間(30、60、90、120、150 min)后進(jìn)行磷鎢酸負(fù)染，電鏡觀察，結(jié)果如圖2所示。正常腺病毒顆粒直徑約為70～90 nm左右，電鏡觀察呈規(guī)則六邊形。腺病毒和納米銀作用30 min后，衣殼完整，但形態(tài)略有改變；在腺病毒和納米銀作用60 min后，納米銀已積聚病毒周?chē)?，腺病毒衣殼雖完整，但已喪失規(guī)則形態(tài)；在腺病毒和納米銀作用90 min后，腺病毒衣殼已破壞，病毒形態(tài)不完整；在兩者作用120 min后，病毒衣殼已完全破壞；在兩者作用150 min后，腺病毒整個(gè)病毒粒子已破壞。

2.6 納米銀對(duì)ADV3核酸的作用

將等體積ddH2O，溶劑，50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL、納米銀與等體積病毒液混合，2 h后進(jìn)行DNA提取，按Hexon進(jìn)行擴(kuò)增后，1%瓊脂糖電泳。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與病毒對(duì)照組和溶劑組相比，納米銀作用后的各實(shí)驗(yàn)組所擴(kuò)增的目的條帶，其亮度均較低，見(jiàn)圖3。

3 討 論

腺病毒可通過(guò)呼吸道分泌物，糞-口途徑和污物在人與人之間傳播，許多嬰兒出生后5年內(nèi)至少感染過(guò)1種腺病毒株，且這種感染常發(fā)生在人群居住較密集的地方。腺病毒感染可發(fā)生在全年的任何時(shí)間，但疫情的爆發(fā)通常都集中在冬季、春季和初夏[4]。腺病毒在低pH值環(huán)境下可穩(wěn)定存在，有很強(qiáng)的耐物理和化學(xué)試劑的作用，腺病毒可對(duì)胃腸分泌物和膽汁產(chǎn)生耐受，在胃腸內(nèi)復(fù)制，可產(chǎn)生很高的病毒載量。腺病毒衣殼主要由五鄰體，六鄰體，纖突構(gòu)成，它們?cè)诓《镜母腥緩?fù)制中都起著關(guān)鍵作用。腺病毒感染細(xì)胞的過(guò)程是從腺病毒纖毛的頭節(jié)區(qū)與宿主細(xì)胞上的科薩奇腺病毒受體(Coxsackie -adenovirus receptor,CAR)結(jié)合，病毒纖毛基底部五鄰體表面的三肽RGD與細(xì)胞表面的αvβ3和αvβ5整合素結(jié)合，通過(guò)內(nèi)吞作用將腺病毒內(nèi)化到細(xì)胞中并進(jìn)入溶酶體[5]。在溶酶體的酸性環(huán)境下，腺病毒衣殼的構(gòu)象將發(fā)生變化，而從溶酶體中釋放出來(lái)，躲過(guò)溶酶體的消化作用。最后，腺病毒顆粒轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，通過(guò)核孔將病毒DNA釋放到細(xì)胞核內(nèi)。

圖2 透射電鏡觀察納米銀在不同時(shí)間下對(duì)ADV3的破壞(200000×)

圖3 不同濃度納米銀與ADV3作用后PCR結(jié)果

病毒感染細(xì)胞并在細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制和繁殖的全過(guò)程包括：病毒對(duì)細(xì)胞的吸附和侵入、脫殼、病毒遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制、子代病毒顆粒的組裝、出芽和釋放。病毒在繁殖的每個(gè)環(huán)節(jié)都可能成為抗病毒藥物作用的靶點(diǎn)，通過(guò)干擾其中的一個(gè)或多個(gè)環(huán)節(jié)來(lái)抑制病毒的復(fù)制和繁殖。銀具有殺菌作用，在牙科、泌尿科、燒傷科應(yīng)用較多。納米銀在生物醫(yī)學(xué)、藥理學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用日益廣泛[6]。與銀化合物相比，納米銀有明顯的物理化學(xué)和生物學(xué)特性，能更好的作用于感染的組織和細(xì)胞表面，納米銀在較低濃度可對(duì)細(xì)菌和真菌產(chǎn)生抑制作用。有關(guān)納米銀抗病毒的文獻(xiàn)已有報(bào)道，納米銀通過(guò)化學(xué)鍵很容易與外來(lái)原子相結(jié)合，使其吸附病毒的能力大大提高。這種結(jié)構(gòu)給各種反應(yīng)提供了作用和接觸吸附位點(diǎn)，與病毒之間相互產(chǎn)生的化學(xué)反應(yīng)能力也快速增強(qiáng)。納米銀在體外可通過(guò)作用于gp120糖蛋白亞單位二硫鍵區(qū)域來(lái)抑制HIV和CD4+T結(jié)合，且<10 nm的納米銀與gp120的結(jié)合呈分子大小依賴(lài)性[7]；納米銀還可以和HBV的雙鏈DNA、胞外病毒粒子結(jié)合，且在體外能抑制HBV RNA 和胞外病毒粒子的產(chǎn)生[8]；納米銀亦能影響猴痘病毒的感染和空斑的形成[9]；經(jīng)由磺化巰基乙烷包被的納米銀可競(jìng)爭(zhēng)性的與宿主細(xì)胞表面的硫酸乙酰肝素結(jié)合，從而阻斷HSV-1進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)引發(fā)一系列感染[10]；納米銀亦可在體外通過(guò)抑制沙粒病毒早期的復(fù)制及RNA的產(chǎn)生和病毒粒子的釋放來(lái)控制其感染[11]。

本實(shí)驗(yàn)探討了納米銀對(duì)腺病毒的抑制作用及其機(jī)制，MTT的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在最大無(wú)毒范圍內(nèi)，在三種不同給藥方式下，實(shí)驗(yàn)組(先ADV3后納米銀、先納米銀后ADV3、納米銀和ADV3體外作用2 h后感染Hela細(xì)胞)與ADV3對(duì)照組相比，差異具有顯著性意義(P<0.01)，說(shuō)明納米銀在體外不僅對(duì)腺病毒的復(fù)制增殖具有抑制作用，且能阻斷腺病毒對(duì)細(xì)胞的感染，還可直接滅活腺病毒。其可能機(jī)制為：納米銀進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，對(duì)胞內(nèi)基因的代謝和表達(dá)起調(diào)節(jié)作用，從而抑制病毒核酸復(fù)制或阻止病毒蛋白合成；納米銀通過(guò)與細(xì)胞表面受體結(jié)合，改變細(xì)胞構(gòu)象，使對(duì)腺病毒敏感的細(xì)胞變?yōu)榉敲舾屑?xì)胞，從而改變細(xì)胞膜上病毒的數(shù)量和結(jié)構(gòu)來(lái)控制病毒的感染；納米銀與ADV3表面特定部位結(jié)合，在腺病毒吸附細(xì)胞的過(guò)程中破壞病毒的衣殼蛋白，阻止病毒的吸附，使病毒不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與ADV3組形成的特異性熒光相比，ADV3感染后再加入納米銀，抑制作用明顯(圖1A)，機(jī)制可能與納米銀進(jìn)入到ADV3感染的Hela細(xì)胞內(nèi)并與病毒結(jié)合，從而抑制了ADV3的復(fù)制及相關(guān)蛋白的表達(dá)；細(xì)胞經(jīng)先納米銀后ADV3處理及納米銀和ADV3直接作用2 h后感染細(xì)胞，幾乎無(wú)熒光(圖1B、1C)，提示納米銀可與ADV3表面的纖突、細(xì)胞表面的CAR以及第二受體整合素等病毒感染相關(guān)蛋白結(jié)合，封閉其作用位點(diǎn)，阻斷ADV3侵入Hela細(xì)胞。透射電鏡結(jié)果顯示，與純病毒形態(tài)相比，在腺病毒和納米銀作用60 min后，納米銀已積聚病毒周?chē)?，腺病毒衣殼完整，但已喪失?guī)則形態(tài)(圖2C)；在腺病毒和納米銀作用90 min后，腺病毒衣殼雖已破壞，病毒形態(tài)不完整(圖2D)；相互作用120 min、150 min后，病毒粒子已完全破壞，病毒喪失完整形態(tài)(圖2E，2F)；說(shuō)明納米銀對(duì)腺病毒體有直接破壞作用，進(jìn)而可能會(huì)影響某些相關(guān)蛋白的表達(dá)和DNA的復(fù)制。PCR結(jié)果顯示，不同濃度納米銀與病毒液混合室溫作用2 h，提取DNA按設(shè)計(jì)的hexon引物進(jìn)行擴(kuò)增，與等體積水和溶劑作用組相比，納米銀作用后目的條帶亮度有所降低，且隨著納米銀濃度增大，擴(kuò)增的目的條帶亮度亦減低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，納米銀對(duì)ADV3 的DNA有一定破壞作用。

本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，納米銀在體外對(duì)腺病毒具有抑制作用，其機(jī)制可能與直接破壞病毒粒子和DNA核酸，病毒衣殼蛋白如五鄰體、六鄰體蛋白等有關(guān)，亦或直接抑制病毒多聚酶的作用或增加新合成DNA的基因突變等影響病毒復(fù)制，從而影響其吸附、胞吞、溶解、釋放及核傳遞等一系列過(guò)程。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)如應(yīng)用Real Time-PCR技術(shù)來(lái)定量腺病毒DNA，Westernblot技術(shù)來(lái)確定納米銀與腺病毒作用后蛋白的破壞與減少程度，或使用探針技術(shù)來(lái)識(shí)別腺病毒及其與納米銀作用后分子標(biāo)記的變化等，值得深入研究。

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