紫外線誘變皮狀絲孢酵母選育高產(chǎn)油脂菌株

李新社，陸步詩，鄧孟橋，殷 桃，胡墩柱

(邵陽學院 生物與化學工程系，湖南 邵陽，422000)

能源是經(jīng)濟社會發(fā)展的重要動力。面對全球社會經(jīng)濟的迅速發(fā)展，人類對能源的需求日益增長，僅中國能源消耗每年就以超過 10%的速度增長[1]。隨著能源需求的日益增長，石油儲量的日益減少、資源逐漸枯竭，全世界正面臨著能源短缺的危機，開發(fā)替代燃料及可再生能源——生物柴油已迫在眉睫。所謂生物柴油是指以植物油、動物脂肪等可再生資源生產(chǎn)的可用于壓燃式發(fā)動機的清潔替代燃油[2]，其突出的環(huán)保性和可再生性，引起了世界各國尤其是資源貧乏國家的高度重視。目前，生物柴油多是利用動、植物脂肪及餐飲廢油為原料制成，受原料成本及收集、運輸?shù)挠绊?，?jīng)濟可行性差。微生物油脂又稱單細胞油脂(SCO)，是酵母、霉菌、細菌和藻類等微生物在一定條件下以碳水化合物、碳氫化合物和普通油脂作為碳源，在菌體內(nèi)產(chǎn)生的大量油脂，可以轉(zhuǎn)化成生物柴油。開發(fā)微生物油脂具有發(fā)酵周期短，不受場地、季節(jié)和氣候影響的特點。據(jù)文獻[3]報道，微生物油脂發(fā)酵是生物柴油產(chǎn)業(yè)和生物經(jīng)濟的重要研究方向。對于微生物油脂發(fā)酵生產(chǎn)研究起步較早，國外主要集中在獲取附加值較高的功能性油脂上[4-7]，國內(nèi)在 20世紀 60年代就有生產(chǎn)微生物油脂的報道。高產(chǎn)油脂突變菌株的選育起始于20世紀90年代，目前，研究和應(yīng)用較多的主要是深黃被孢霉、斯達氏酵母、紅酵母以及假絲酵母等[8-13]。利用皮狀絲孢酵母生產(chǎn)微生物油脂的研究很少。為此，本文作者以皮狀絲孢酵母(Trichosporon cutaneum)GIM 2.68為出發(fā)菌株，利用紫外線誘變，以篩選出高產(chǎn)油脂突變菌株，以便為發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂提供新的生產(chǎn)菌株。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

材料為：皮狀絲孢酵母(Trichosporon cutaneum，GIM2.68)菌種，由廣東微生物研究所菌種保藏中心提供；麥芽，由湖南省邵陽市百惠啤酒廠提供。

儀器為：紫外線分光光度計、恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、超凈工作臺、立式高壓蒸汽滅菌鍋、振蕩式精密恒溫水浴槽、離心機、顯微鏡、電子分析天平、紫外燈、磁力攪拌器、血球計數(shù)板等。

試劑為：蔗糖、瓊脂、蘇丹黑、二甲苯、沙黃，為市售化學純商品；鹽酸、氯仿、甲醇等，為市售分析純商品。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制

(1) 麥芽汁培養(yǎng)基(菌種活化與培養(yǎng)用)配制：取1 kg大麥芽，加55～60 ℃溫水 4 kg左右，在55～60 ℃水浴鍋中保溫糖化 3～4 h，至液體中加碘無淀粉反應(yīng)為止。先用紗布過濾，煮沸20 min后分別用定性和定量濾紙各過濾 1次，調(diào)節(jié)糖度至 10°Be′(含糖量約18 g/(100 mL))，固體培養(yǎng)基的瓊脂添加量為 1.5%～2.0%，分裝后加棉塞并包扎好，于121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min[14]。

(2) 麩皮斜面培養(yǎng)基(菌種保藏用)配制：麩皮30 g，加300 mL水，煮沸30 min，過濾，濾液加入3 g蔗糖及適量無機鹽混合液，加入2%瓊脂，熔化定容至300 mL，于121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2.2 菌種的活化和擴大培養(yǎng)

在無菌條件下取少量菌種接種至麥芽汁斜面培養(yǎng)基中，于28 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，獲得活化菌種。將菌種活化2～3次。將已活化的斜面培養(yǎng)基上的菌種刮落到定量無菌水中，充分搖勻后移取一定量菌液至新鮮的麥芽汁液體培養(yǎng)基中，在 28 ℃下恒溫振蕩擴大培養(yǎng)2 d。

1.2.3 生長曲線的繪制

取25支20 mL試管，分別裝等量(10.0 mL)同種麥芽汁液體培養(yǎng)基滅菌備用。用移液管向每只試管中移取經(jīng)過充分搖勻的皮狀絲孢酵母擴大培養(yǎng)液 0.5 mL，放入搖床發(fā)酵培養(yǎng)箱中于28 ℃恒溫培養(yǎng)。每2 h從培養(yǎng)箱中取出1支試管并且編號放入冰箱冷藏。待所有試管全部拿出時，在波長600 nm下用紫外分光光度計進行檢測并記錄吸光度。

1.2.4 生物量的檢測

將定量培養(yǎng)液置于離心管中在轉(zhuǎn)速4 500 r/min下離心10 min，除去上清液，收集下面固形物于三角瓶中干燥(干燥溫度為80 ℃)至質(zhì)量恒定，用電子分析天平稱取干菌體質(zhì)量，計算生物量。每個樣品做平行試驗3次。

1.2.5 油脂質(zhì)量的檢測

將培養(yǎng)液用凍融法(在-30 ℃與37 ℃反復凍融3次，再進行超聲破碎) 使細胞破裂，在轉(zhuǎn)速4 000 r/min下離心15 min取上清液，分別添加適量(約40 mL)鹽酸水解，于室溫下靜置20 min，用沸水浴加熱10 min，加入適量(約50 mL)氯仿與甲醇(體積比為1∶1)的混合液，振蕩30 min，置于1 000 mL分液漏斗中分液，取氯仿層，真空干燥除去氯仿即得油脂，稱取油脂質(zhì)量[15]，并計算油脂得率η。每個樣品做平行試驗3次。

η＝[m(粗油脂)/m(干菌體)]×100%

1.2.6 紫外線誘變

將皮狀絲孢酵母活化種移入麥芽汁液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞，用玻璃珠振蕩10～15 min，使細胞充分分散，用無菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌液濃度為108個/mL。打開紫外燈(25 W)預(yù)熱20 min，在直徑為6 cm的無菌平皿中注入10 mL菌液，在磁力攪拌器作用下于紫外燈下(功率25 W，照射距離36 cm)分別照射10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，110和120 s，暗箱保藏2～3 h，在紅燈下分別稀釋10倍和100倍后各取0.10 mL菌液進行平板涂布，在28℃恒溫培養(yǎng)2 d，統(tǒng)計平板上菌落個數(shù)。以未經(jīng)照射的菌液為對照，計算致死率并繪制紫外線致死曲線[16]。

1.2.7 突變菌株的初篩

吸取在最佳誘變條件下的誘變菌液進行 10倍稀釋(10-1，10-2，10-3)后涂布平板，在28 ℃下恒溫培養(yǎng)2 d，觀察平板上菌落的形態(tài)特征。取菌涂片，用蘇丹黑染色15 min，二甲苯?jīng)_洗，至無色時再用沙黃復染，水洗，吸干后鏡檢。在顯微鏡下菌絲呈紅色，菌體內(nèi)的脂肪顆粒呈藍黑色[17]。選取顯微鏡下觀察顏色較深的菌落進行復篩。

1.2.8 突變菌株的復篩

分別選取初篩含脂量較出發(fā)菌株高(顏色較深)的突變菌落適量，用無菌生理鹽水調(diào)節(jié)至相同菌液濃度，分別取2 mL接種至100 mL液體培養(yǎng)基上，在28 ℃下?lián)u床恒溫培養(yǎng)2 d后，檢測生物量與油脂產(chǎn)量。

1.2.9 菌種的保藏

選取生物量與油脂得率高的菌株移接至麥芽汁斜面培養(yǎng)基上，經(jīng)過多次連續(xù)傳代，選育性能穩(wěn)定的菌株保藏于麩皮斜面培養(yǎng)基上。

2 結(jié)果與分析

2.1 皮狀絲孢酵母生長曲線

將皮狀絲孢酵母接種活化后，接種在麥芽汁中，于28 ℃恒溫培養(yǎng)，每2 h取樣，在600 nm波長下用紫外分光光度計進行紫外檢測并記錄吸光度。皮狀絲孢酵母的生長曲線見圖1。

1)氣象廣域網(wǎng):采用“雙路由器+雙線路”冗余備份模式,使用全省統(tǒng)一的OSPF路由協(xié)議實現(xiàn)鏈路冗余,任何一條線路故障,均能通過OSPF自動收斂實現(xiàn)鏈路自動切換,保障氣象業(yè)務(wù)的連續(xù)性;配置兩臺鏈路防火墻用于風險防御和訪問控制。

圖1 皮狀絲孢酵母生長曲線Fig.1 Growth curve of Trichosporon cutaneum

由圖1可以看出：皮狀絲孢酵母的1個生長周期為36 h，其中從開始培養(yǎng)至12 h為適應(yīng)期，12～20 h為對數(shù)生長期，20～28 h為穩(wěn)定生長期。穩(wěn)定期后，由于細胞繁殖越來越慢，菌體自溶，死亡數(shù)越來越多，細胞進入衰亡期；培養(yǎng)12 h后進入對數(shù)生長期，表明該菌對環(huán)境適應(yīng)性較強；衰亡期曲線較平穩(wěn)，表明菌體自溶微弱，在培養(yǎng)過程中菌體形態(tài)較為單一。由于對數(shù)生長期的細胞為生理活性一致的活細胞，突變率高，重現(xiàn)性好，因此，選取培養(yǎng)14 h后的皮狀絲孢酵母作為誘變出發(fā)菌株。

2.2 皮狀絲孢酵母紫外線致死曲線

將對數(shù)生長期的出發(fā)菌株在 UV下照射不同時間，通過平板活菌計數(shù)法得出照射后活細胞含量，計算致死率。皮狀絲孢酵母的紫外線致死曲線見圖2。

圖2 皮狀絲孢酵母的紫外線致死曲線Fig.2 UV death curve of Trichosporon cutaneum

由圖2可以看出：照射時間在20 s以內(nèi)時，紫外線誘變對皮狀絲孢酵母影響不大；而大于60 s時，菌體死亡率為90%以上。由于正突變多發(fā)生在致死率為70%～80%，因此，選用紫外線照射50 s后，菌體的死亡率為70%，作為最佳處理劑量進行誘變。

2.3 突變菌株的篩選

2.3.1 突變菌株的初篩

將紫外線照射50 s后的皮狀絲孢酵母菌液在麥芽汁平板上進行涂布，在28 ℃下恒溫培養(yǎng)2 d，觀察平板上菌落的形態(tài)特征并對平板上長出的所有菌落取菌涂片，用蘇丹黑染色后在顯微鏡下進行鏡檢，將蘇丹黑染色較深的10個涂片分別用Tc1，Tc2，Tc3，…，Tc10標記，其顯微鏡檢像見圖3。

由圖3可以看出：選出的10個菌株蘇丹黑染色顏色明顯較出發(fā)菌株的深，表明這10個菌株細胞的脂肪含量高于出發(fā)菌株含量。在10個蘇丹黑染色顏色較深的菌株中，相對較深的是Tc1，Tc3，Tc5，Tc6和Tc10菌株，因此，選取這5個菌株進行復篩。

2.3.2 突變菌株的復篩

圖3 蘇丹黑染色鏡檢像Fig.3 Microscope images with Sudan black staining

表1 突變菌株生物量與油脂產(chǎn)量檢測結(jié)果Table1 Test results of mutant biomass and oil production

由表1可知：Tc3菌株油脂的產(chǎn)量最高，為0.374 8 g/(100 mL)；Tc1菌株油脂的產(chǎn)量次之，為 0.261 9 g/(100 mL)；Tc3菌株的生物量為1.047 0 g/(100 mL)，Tc1菌株的生物量為0.854 1 g/(100 mL)；Tc3菌株油脂得率為35.8%，Tc1菌株油脂得率為30.6%。研究結(jié)果顯示：生物量、油脂產(chǎn)量與油脂得率之間呈現(xiàn)一定的正相關(guān)性，表明細胞內(nèi)油脂是在菌細胞生長過程中積累的。細胞生長速度越快，單位時間內(nèi)細胞數(shù)量越多，生物量越大，則積累油脂越多。對于發(fā)酵生產(chǎn)，細胞生長速度越快，生產(chǎn)周期越短，越有利于提高生產(chǎn)效率，降低產(chǎn)品成本。因此，確定Tc3菌株為高產(chǎn)油脂突變菌株。

2.4 Tc3菌株與出發(fā)菌株比較

將Tc3菌株與出發(fā)菌株以相同的接種量接種到麥芽汁培養(yǎng)基中，在28 ℃下恒溫搖床培養(yǎng)2 d后，檢測生物量與油脂產(chǎn)量，結(jié)果見表2。

表2 Tc3菌株和出發(fā)菌株的生物量與油脂產(chǎn)量檢測結(jié)果Table2 Test results of biomass and oil production of Tc3 strain and original strain

由表2可知：與出發(fā)菌株相比，Tc3菌株生物量提高 38.81%，油脂產(chǎn)量提高 86.10%，油脂得率提高34.09%。

2.5 Tc3菌株的傳代與保藏

2.5.1 Tc3菌株的傳代

將篩選到的 Tc3菌株接種到麥芽汁斜面培養(yǎng)基上，于28 ℃下恒溫培養(yǎng)2 d(共活化3次)，移接至麥芽汁液體培養(yǎng)基中(三角瓶)，于28 ℃下恒溫振蕩培養(yǎng)2 d后測試生物量與產(chǎn)脂性能，結(jié)果見表3。

表3 Tc3菌株生物量與油脂產(chǎn)量檢測結(jié)果Table3 Test results of biomass and oil production of Tc3 strain

由表3可知：經(jīng)多次傳代后，Tc3菌株的生物量為1.046 9 g/(100 mL)，油脂產(chǎn)量為0.372 5 g/(100 mL)，油脂得率為 35.6%，與傳代前相比，生物量與產(chǎn)脂性能基本穩(wěn)定。結(jié)果表明：利用誘變獲得的高產(chǎn)油脂突變菌株作為油脂發(fā)酵生產(chǎn)用菌株，具有一定的應(yīng)用性。如果對該突變株的培養(yǎng)基配方進行研究并進一步在發(fā)酵罐水平上對油脂的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，研究最適發(fā)酵動力學條件(溫度、時間、pH、溶氧量、攪拌速度、接種量、培養(yǎng)基)，油脂產(chǎn)量有望進一步提高。

2.5.2 突變菌株的保藏

將經(jīng)過多次傳代后生物量與產(chǎn)脂性能穩(wěn)定的突變菌株移接到麩皮斜面培養(yǎng)基上，在 28 ℃下恒溫培養(yǎng)2 d后，置于溫度為4 ℃的冰箱中保藏。

3 結(jié)論

(1) 皮狀絲孢酵母的生長周期為 36 h，從開始培養(yǎng)至12 h為適應(yīng)期，培養(yǎng)12～20 h為對數(shù)生長期，培養(yǎng)20～28 h為穩(wěn)定生長期。

(2) 利用25 W紫外燈，在照射距離為36 cm條件下，照射50 s，可以篩選到生物量為1.047 g/(100 mL)，油脂產(chǎn)量為0.374 8 g/(100 mL)，油脂得率為35.8%的突變菌株 Tc3。與出發(fā)菌株相比，生物量提高了38.81%，油脂產(chǎn)量提高了 86.10%，油脂得率提高了34.09%。結(jié)果表明：誘變篩選方法是有效的，利用突變菌株生產(chǎn)微生物油脂具有一定的可行性。

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