細(xì)胞凋亡相關(guān)的斑點樣蛋白與半胱氨酸蛋白酶-1在淋巴瘤中的表達(dá)及臨床意義

江興林，左云飛

1.懷化醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，湖南懷化 418000；2.大連醫(yī)科大學(xué)，遼寧大連 116044

細(xì)胞凋亡相關(guān)的斑點樣蛋白（apoptosis-associated specklike protein，ASC）是含有胱天蛋白酶募集結(jié)構(gòu)域（caspase recruitment domain，CARD）的與細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白活化因子，細(xì)胞凋亡或程序性細(xì)胞死亡是正常發(fā)育和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的必要過程[1]。很多研究證實在許多腫瘤中，腫瘤樣改變和腫瘤細(xì)胞的生長與細(xì)胞凋亡的抑制密切相關(guān)。有報道在一些腫瘤細(xì)胞株中ASC表達(dá)增高時能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，并且其定位可使細(xì)胞溶質(zhì)結(jié)構(gòu)更清晰[2]；細(xì)胞凋亡程序被觸發(fā)后，執(zhí)行細(xì)胞凋亡程序，需依賴Caspase（半胱氨酸蛋白酶）家族的激活[3-5]。因此，ASC、Caspase家族在細(xì)胞凋亡的信號通路中均具有重要作用。已有研究表明ASC表達(dá)增高能通過腫瘤壞死因子和活化caspase-8使凋亡信號放大[6]。同時有研究證實，ASC基因啟動子的頻繁甲基化在前列腺癌、肝癌、乳腺癌及黑色素瘤中普遍存在[3-4，7-8]。說明ASC基因被甲基化而不表達(dá)，不能觸發(fā)細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致癌的發(fā)生。該基因編碼的銜接蛋白ASC還參與免疫反應(yīng)、炎性反應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過Caspase結(jié)構(gòu)域與Caspase-1結(jié)合，進(jìn)一步使Caspase-1活化，引起致炎細(xì)胞因子、IL-1和IL-18的激活與分泌，實現(xiàn)對腫瘤的抑制。本實驗通過對淋巴瘤及癌旁組織中ASC、Caspase-1的表達(dá)情況采用免疫組織化學(xué)方法測定，探討其表達(dá)跟淋巴瘤發(fā)生和發(fā)展及與臨床的聯(lián)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

從大連醫(yī)科大學(xué)附二院和湖南腫瘤醫(yī)院選取1995年1月～2007年1月通過病理學(xué)證實的淋巴瘤和相應(yīng)癌旁組織石蠟包埋標(biāo)本各30例，術(shù)前均未接受放、化療，其中，男21例，女9例；年齡33～85歲，平均47歲。由病理醫(yī)師對切片進(jìn)行復(fù)查確診，按Dukes分期進(jìn)行臨床病理分期，其中，A期6例，B期15例，C期6例，D期3例。

1.2 方法

免疫組化操作按LSAB免疫組化試劑盒說明進(jìn)行，陰性對照中一抗采用PBS代替，陽性對照采用已知的陽性標(biāo)本。具體操作：石蠟切片依次用二甲苯、無水乙醇、95%乙醇、70%乙醇、自來水洗脫蠟水化，98℃枸櫞酸鈉液中修復(fù)抗原，3%H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶。正常山羊血清封閉非特異性抗原，分別滴加 ASC、Caspase-1 一抗（1∶200 稀釋），4℃冰箱過夜，滴加生物素標(biāo)記的二抗。加入LSAB復(fù)合物。DAB顯色，蘇木素染液復(fù)染，65℃水中藍(lán)化，依次在75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無水乙醇、二甲苯中脫水，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.3 觀察指標(biāo)

陽性細(xì)胞為在細(xì)胞中染棕黃色。隨機(jī)觀察5個高倍視野（×400），計算陽性細(xì)胞數(shù)百分比。 ASC、Caspase-1陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)＜25%為陰性，≥25%為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，率的比較用χ2檢驗或 Fisher's Exact Test。

2 結(jié)果

2.1 在淋巴瘤及癌旁組織中ASC的表達(dá)

ASC陽性染色主要在細(xì)胞漿中染棕黃色，胞核少數(shù)可見，見圖1A。淋巴瘤組織及癌旁組織中ASC陽性率分別為16.67%（5/30）與 76.67%（23/30），組間陽性表達(dá)率差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表 1。

2.2 在淋巴瘤及癌旁組織中Caspase-1的表達(dá)

Caspase-1陽性染色主要在細(xì)胞漿中染棕黃色，胞核少數(shù)可見，見圖1B。淋巴瘤組織及癌旁組織陽性率分別為26.67%（8/30）與 63.33%（19/30），組間陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表 1。

2.3 在淋巴瘤及癌旁組織中ASC與Caspase-1表達(dá)分析

ASC與Caspase-1兩指標(biāo)在淋巴瘤組織中的表達(dá)均低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2；而在癌旁組織中兩指標(biāo)表達(dá)均增高，且高度相關(guān)（P＜0.01），見表 3。

3 討論

SC是一種與細(xì)胞凋亡相關(guān)的抑癌基因，屬于CED4/Apaf1基因家族，其基因定位于16p11.2-12[2]，編碼的蛋白質(zhì)分子量為22 kDa，C-末端含有半胱氨酸蛋白酶募集結(jié)構(gòu)域（a caspase recruitment domain， CARD），是與細(xì)胞凋亡信號有關(guān)的蛋白質(zhì)，N-末端為熱蛋白樣結(jié)構(gòu)域（a pyrin domain，PYD），是參與免疫反應(yīng)有關(guān)的蛋白質(zhì)。ASC可在許多正常組織中表達(dá)，如在結(jié)腸組織中，ASC在高分化的上皮細(xì)胞絨毛端表達(dá)高，這樣通過細(xì)胞凋亡以維持細(xì)胞的不斷更新[9]，而ASC在低分化的毛囊細(xì)胞中不表達(dá)[3]。其他組織如甲狀腺、脾、小腸、肺、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等中亦有同樣現(xiàn)象，依此可推測，在構(gòu)建和維持細(xì)胞分化狀態(tài)中ASC可能起作用，與正常上皮細(xì)胞的增殖及分化信號相關(guān)。提示：在腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織中ASC表達(dá)是降低的。許多研究證實ASC在不同類型細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)中具有明顯的作用，成為癌治療的新靶點[10]。當(dāng)ASC表達(dá)缺失時組織易發(fā)生癌變。如在黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、膽管癌、人類結(jié)腸癌細(xì)胞株中的研究中均發(fā)現(xiàn)由于ASC基因的異常甲基化，導(dǎo)致ASC不表達(dá)或表達(dá)減少[4-5，11]。同樣在肝癌的研究中也發(fā)現(xiàn)，具有與ASC的Pyrin結(jié)構(gòu)域同源性很高的蛋白（ASC-Like，ASCL）的編碼基因，甲基化程度在肝細(xì)胞癌細(xì)胞株中高達(dá)80%，而在肝細(xì)胞正常樣本中甲基化不明顯。在肝細(xì)胞癌樣品中，觀察到ASCL和ASC的甲基化均為53%。用脫甲基化試劑5′-乙酰唑胺2′-脫氧胞苷酸能使ASCL因甲基化不表達(dá)的細(xì)胞再生[8]。另外，ASC缺少可激活NF-κB途徑，NF-κB激活可引起腫瘤細(xì)胞增殖，引起腫瘤在血管生成及轉(zhuǎn)移。在上皮源性腫瘤和白血病、淋巴瘤中，由于ASC基因表達(dá)缺失而抑制細(xì)胞凋亡，也可能激活NF-κB。表明ASC基因在淋巴瘤中的發(fā)展起重要作用，能成為淋巴瘤防治的一個有希望的靶點。本實驗的結(jié)果顯示，在淋巴瘤中ASC的表達(dá)顯著低于癌旁組織（P＜0.01），跟以往報道的因ASC基因甲基化而在各類癌中表達(dá)減少一致。

Caspase為半胱氨酸蛋白水解酶家族，包括3大類型：啟動型、效應(yīng)型和炎癥型。與細(xì)胞凋亡和機(jī)體免疫反應(yīng)密切相關(guān)。其中Caspase-2、8、9、10屬于啟動型，活化后可啟動細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)效應(yīng)型 Caspase；Caspase-3、6、7屬于效應(yīng)型，可水解細(xì)胞蛋白，引起細(xì)胞凋亡；Caspase-1、4、5等屬于炎癥型，活化后可引起一系列的炎癥因子的釋放，進(jìn)一步導(dǎo)致炎癥反應(yīng)[12]。Caspase-1為炎癥反應(yīng)過程的重要作用物質(zhì)。很多的研究證實，ASC可作為銜接蛋白通過Caspase補(bǔ)充區(qū)域（CARD），以CARD/CARD途徑與原Caspase-1特異結(jié)合，使其活化，然后引起IL-1和IL-18等炎癥細(xì)胞因子的成熟與活化[11-13]，推測ASC可能通過激活caspase-1信號途徑來實現(xiàn)它的抗腫瘤效應(yīng)。機(jī)體可通過免疫系統(tǒng)達(dá)到識別和殺死癌細(xì)胞之目的。有報道IL-18在多發(fā)性鼠腫瘤模型中有顯著的抗腫瘤效應(yīng)。如T細(xì)胞受到腫瘤細(xì)胞的刺激而活化，或釋放細(xì)胞因子，活化IL-18、IL-1B，實現(xiàn)抗腫瘤功能。當(dāng)ASC缺失時，能使免疫細(xì)胞活化、增殖和抗腫瘤效應(yīng)受影響[14]。本實驗表明，淋巴瘤組織與癌旁組織中Caspase-1表達(dá)存在顯著差異（P＜0.01），雖在淋巴瘤組織中ASC與Caspase-1兩者表達(dá)都減少，但差異不明顯（P＞0.05），而在癌旁組織中表達(dá)均顯著增高（P＜0.01）。結(jié)果顯示，Caspase-1的表達(dá)可能依賴ASC的介導(dǎo)。

表1 在淋巴瘤組織及癌旁組織中ASC、Caspase-1表達(dá)結(jié)果的比較（例）

表2 在淋巴瘤組織中ASC與Caspase-1表達(dá)結(jié)果的比較（例）

表3 在癌旁組織中ASC與Caspase-1表達(dá)結(jié)果的比較（例）

總之，本實驗表明在淋巴瘤組織中ASC、Caspase-1表達(dá)減少；雖在淋巴瘤組織中2個指標(biāo)表達(dá)都降低，但無相關(guān)性；而在癌旁組織中2個指標(biāo)中表達(dá)均增高，且高度相關(guān)。提示，在淋巴瘤的凋亡、發(fā)生和發(fā)展過程中，ASC、Caspase-1與之密切相關(guān)，可成為淋巴瘤的診斷及治療有希望的靶點。

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