Ⅰ型鴨肝炎病毒PCR-DHPLC檢測(cè)方法的建立

孫 濤,肖西志,徐 彪,梁成珠,凌宗帥,張?zhí)?岳志芹

(1.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局,山東青島 266002;2.濰坊出入境檢驗(yàn)檢疫局,山東濰坊 261041;3.濟(jì)南出入境檢驗(yàn)檢疫局,山東濟(jì)南 250014)

Ⅰ型鴨肝炎病毒PCR-DHPLC檢測(cè)方法的建立

孫 濤1,肖西志1,徐 彪1,梁成珠1,凌宗帥3,張?zhí)?,岳志芹1

(1.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局,山東青島 266002;2.濰坊出入境檢驗(yàn)檢疫局,山東濰坊 261041;3.濟(jì)南出入境檢驗(yàn)檢疫局,山東濟(jì)南 250014)

用RT-PCR結(jié)合變性高效液相色譜技術(shù)(DHPLC),建立Ⅰ型鴨肝炎病毒的快速檢測(cè)方法。根據(jù)獲得的Ⅰ型鴨肝炎病毒(DHV I)RNA聚合酶基因序列,應(yīng)用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)了1對(duì)引物,RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)變性高效液相色譜進(jìn)行快速檢測(cè)。以正常鴨胚尿囊液、正常鴨肝組織、鴨瘟病毒、番鴨細(xì)小病毒、鵝細(xì)小病毒、H5N1亞型禽流感病毒、鴨源新城疫病毒、傳染性法氏囊病病毒作對(duì)照進(jìn)行特異性檢測(cè);將強(qiáng)毒株核酸稀釋成不同梯度,做靈敏度檢測(cè);同時(shí)將該方法與病毒分離和熒光定量RT-PCR方法做人工感染樣品的平行檢測(cè)。結(jié)果表明,該方法有很好的特異性,且靈敏度高,檢測(cè)限可達(dá)到4 pg的DHV I核酸模板,與熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果一致。PCR-DHPLC對(duì)DHV Ⅰ強(qiáng)毒株人工感染鴨組織臟器的檢測(cè)結(jié)果與熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果的陽性檢出率均為100%,對(duì)腦、脾、肺病料的檢出率顯著(P≤0.01)高于病毒分離,PCR-DHPLC與熒光RT-PCR檢測(cè)方法相比較,兩種方法檢測(cè)DHVⅠ的符合率為100%。研究表明該方法可用于診斷Ⅰ型鴨肝炎病毒,是一種有效的新方法。

Ⅰ型鴨肝炎病毒;RT-PCR;變性高效液相色譜

Ⅰ型鴨病毒性肝炎(Serotype I duck viral hepatitis,DVH I)是由Ⅰ型鴨病毒性肝炎病毒(Duck hepatitis virus serotypeⅠ,DVHⅠ)引起的雛鴨的一種急性高度致死性傳染病[1],主要侵害3周齡以內(nèi)的雛鴨,以肝炎為特征,病死率可達(dá)90%以上,是危害養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴(yán)重的傳染病之一。DHV有Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型,3個(gè)型有著明顯的差異,無交叉免疫性[2]。DVHⅠ最先于1950年在美國發(fā)現(xiàn)[3],我國于1963年在上海首次報(bào)道了該病的臨床病例,目前,在全國各養(yǎng)鴨地區(qū)均有不同程度的發(fā)生和流行[4]。針對(duì)該病,現(xiàn)已有多種檢測(cè)DHVⅠ抗原的的方法,如病毒中和試驗(yàn)、免疫電鏡[5]、Dot-ELISA[6]和RT-PCR[7-8]等,這些方法在DVHⅠ的診斷中各有優(yōu)勢(shì),但還達(dá)不到高通量集成化診斷的要求[9-10]。因此,需要研究一種能夠?qū)喐窝撞《具M(jìn)行高通量快速排查、準(zhǔn)確鑒別的集成化診斷技術(shù)。變性高效液相色譜(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)是近年發(fā)展起來的一種簡單、快速、非凝膠的核酸分析方法,它利用樣品分子對(duì)固定相親和力的差異,在用流動(dòng)相洗脫時(shí),不同大小或者不同序列的核苷酸片段分子在固定相上移動(dòng)速率不同而達(dá)到分離的目的[11]。一般來說,產(chǎn)物分子相差1%的片段即能夠被分開。例如,100 bp的產(chǎn)物能和101 bp的產(chǎn)物分開,而用常規(guī)8 g/L的瓊脂糖凝膠電泳,其相差10 bp的片段大小也是無法被分離。因此,利用 DHPLC可以區(qū)分不同長度 DNA片段的特點(diǎn),進(jìn)行細(xì)微差異的DNA序列分析即可從毒株水平快速識(shí)別各亞型病原。根據(jù)各種亞型特有基因組序列,設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,然后利用DHPLC檢測(cè),一次可以同時(shí)分析數(shù)百個(gè)樣本,達(dá)到快速檢測(cè)Ⅰ型鴨肝炎的目的。目前國內(nèi)外已見報(bào)道用于進(jìn)行大腸埃希菌等食品微生物的檢測(cè)鑒別[12-14]、致病微生物耐藥菌株的鑒別篩選及遺傳疾病的基因診斷[15-16]等。DHPLC技術(shù)根據(jù)核酸檢測(cè)分析要求,可采用非變性、部分變性和完全變性幾種不同的分析模式,基于核酸擴(kuò)增片段差異的微生物鑒別檢測(cè)技術(shù)采用非變性分析模式。本文采用核酸擴(kuò)增與非變性DHPLC分析相結(jié)合的技術(shù)原理,首次建立了快速檢測(cè)鴨病毒性肝炎的高通量檢測(cè)分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試驗(yàn)材料 Ⅰ型DHV強(qiáng)毒株(含毒鴨胚尿囊液)為四川農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病研究中心惠贈(zèng);鴨瘟病毒(duck plague virus,DPV)、番鴨細(xì)小病毒(MPV)、鵝細(xì)小病毒(GPV)、傳染性法氏囊病病毒由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈(zèng);禽流感病毒H5N1亞型核酸材料、鴨源新城疫病毒核酸材料由山東出入境檢驗(yàn)檢疫局食品農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)中心禽病實(shí)驗(yàn)室保存。1日齡櫻桃谷鴨(經(jīng)ELISA檢測(cè)器血清中DVH I抗體陰性)購自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所。

1.1.2 主要試劑 M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Razoal RNA提取試劑盒購自Promega公司;鴨病毒性肝炎熒光定量檢測(cè)試劑盒為本室自行研發(fā);PCR擴(kuò)增用酶,采用TOYOBO公司KOD-PLUS DNA polymerase;三乙胺乙酸鹽(TEAA,色譜純)購自T ransgenomic公司;乙腈(色譜純)購自 TEDIA 公司;引物由上海Invitrogen生物技術(shù)公司合成;胰化蛋白胨、酵母抽提物;瓊脂糖、氨芐青霉素等均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;硅膠膜型質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、Gold-View TM 染色劑均購自北京博瑞克基因技術(shù)有限公司。其他常規(guī)化學(xué)試劑購自北京化學(xué)試劑公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備及生物信息學(xué)分析軟件 變性高效液相色譜儀器(T ransgenomic Wave 4500)為北京環(huán)球基因公司產(chǎn)品;AllegraTM21R高速冷凍離心機(jī)為BeckmanCoulter公司產(chǎn)品;Sigma1-15普通離心機(jī)為Sigma公司產(chǎn)品;Premer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 通過Internet登陸美國國立生物信息技術(shù)中心(NCBI),查詢檢索已公布的鴨肝炎病毒RNA聚合酶基因序列。利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物(表1)。

表1 設(shè)計(jì)的引物和預(yù)期目的片段大小Table 1 Primers and size of expected products

1.2.2 人工感染試驗(yàn) 健康的1日齡櫻桃谷鴨30只,隨機(jī)分成 A、B 2組。A組 20只,每只皮下注射1萬個(gè)LD50的DHV Ⅰ型強(qiáng)毒株,采集發(fā)病死亡鴨的心 、肝、脾、肺 、腦,置-20 ℃保存;B 組 10 只,每只皮下注射無菌生理鹽水作正常對(duì)照。

1.2.3 病毒株RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄 含毒尿囊液經(jīng)10 000 r/min離心5min后取上清。人工感染病變肝組織0.3 g,按1∶5用生理鹽水研磨,凍融3次,8 000 r/min離心 10 min,取上清。使用 Promega公司提供的Razoal一步法試劑盒提取 RNA保存?zhèn)溆?具體方法按RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行,用同樣方法從正常鴨胚尿囊液和健康鴨的肝臟中提取核酸作為對(duì)照。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用Promega公司的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶對(duì)病毒RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。取5 μ L已制備的RNA,加入20 pmoL通用引物,70℃熱吸附 5 min,繼續(xù)加入5×Fisrt standing buffer 4 μ L,0.1 M DT T 2 μ L,2.5 mmol/L dNTPs 2 μ L,M-MLV 1 μ L,RNase out 1 μ L,DEPC 水4 μ L,37 ℃作用1 h,95 ℃5 min。

1.2.4 RT-PCR體系的建立 確定 RT-PCR的最佳反應(yīng)模式,將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋,分別對(duì) PCR 反應(yīng)的引物(0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 μ mol/L),Mg2+(0.5、1.25、2、2.75、3.5 mmol/L),dNTP(0.02、0.05、0.12、0.25、0.5 mmol/L),TaqDNA 聚合酶(0.005、0.01、0.02、0.05 、0.1 U/μ L),退火溫度(45、50 、55、59、62 ℃)、循環(huán)次數(shù)(20、25、30、35、40 循環(huán))進(jìn)行優(yōu)化 ,建立針對(duì)該病毒的RT-PCR最佳反應(yīng)體系。

1.2.5 DHPLC分析條件 色譜柱:PS-DVB﹠C18 DNASep色譜柱(4.6 mm×50 mm,粒度3 μ m);柱溫:50 ℃;流動(dòng)相:0.0 min,55%緩沖溶液A,45%緩沖溶液B;0.5 min,50.2%緩沖溶液A,49.8%緩沖溶液B;2.4min,44.2%緩沖溶液A,55.8%緩沖溶液B;4.3 min,40.9%緩沖溶液A,59.1%緩沖溶液B;6.1 min,38.8%緩沖溶液A,61.2%緩沖溶液B;8 min,37.3%緩沖溶液A,62.7%緩沖溶液 B;流速:0.9 mL/min;檢測(cè)器:熒光檢測(cè)器(光源:150 W Xenon燈;激發(fā)譜帶寬:15 nm;發(fā)射譜帶寬:15.3 nm;檢測(cè)靈敏度:在波長350 nm積分2 s);上樣量:PCR產(chǎn)物 5 μ L。在非變性分析模式下,采用雙鏈 DNA多片段(double-stranded multiple fragment)分析模式,清洗模式采用Active,分析檢測(cè)過程儀器梯度由Navigator software分析軟件控制設(shè)定。

1.2.6 RT-PCR產(chǎn)物鑒定 依據(jù)1.2.4摸索的RT-PCR擴(kuò)增條件,將反應(yīng)體系增加到100 μ L以獲得足夠量的目的片段。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物依次用DNA純化回收試劑盒純化,純化產(chǎn)物送與南京金思特公司測(cè)序。

1.2.7 PCR-DHPLC的特異性分析 對(duì)Ⅰ型鴨肝炎病毒及對(duì)照正常尿囊液進(jìn)行同樣步驟的RNA提取,與鴨瘟病毒(DPV)、番鴨細(xì)小病毒(MPV)、鵝細(xì)小病毒(GPV)、H5N1亞型禽流感病毒(AIV)、鴨源新城疫病毒(NDV)、傳染性法氏囊病病毒(IBDV)、按照RT-PCR擴(kuò)增條件和DHPLC分析條件一同進(jìn)行特異性試驗(yàn),同時(shí)以SPF尿囊液和健康鴨肝組織RNA為陰性對(duì)照。

1.2.8 多重PCR敏感性分析 DHVⅠ強(qiáng)毒株核酸經(jīng)過核酸蛋白儀檢測(cè)定量后,用雙蒸水稀釋成每10 μ L含 4×105、4×104、……,4×10-2pg核酸共計(jì)8個(gè)稀釋度,各取10 μ L分別進(jìn)行 PCR-DHPLC和熒光定量PCR檢測(cè)。

1.2.9 PCR-DHPLC在檢測(cè)DVH Ⅰ中的應(yīng)用將采集的人工感染死亡鴨的心、肝、脾、肺、腦,分別用病毒分離法,熒光定量PCR法和PCR-DHPLC方法同步進(jìn)行檢測(cè),并將結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR最佳反應(yīng)條件的建立與產(chǎn)物的鑒定

經(jīng)過比較篩選,DVH的RT-PCR最佳反應(yīng)條件參數(shù)為 :引物各 0.2 μ mol/L;Mg2+為 2 mmol/L;TaqDNA聚合酶0.05 U/μ L;反應(yīng)循環(huán)數(shù)為35;最佳退火溫度為55℃,將已知鴨肝炎病毒RT-PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果通過DNASTAR軟件與GenBank中相關(guān)毒株進(jìn)行分析比較。同源性均高達(dá)98%以上。表明PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為預(yù)期目標(biāo)產(chǎn)物。

2.2 PCR-DHPLC的特異性結(jié)果

RT-PCR擴(kuò)增后,經(jīng)DHPLC分析,出現(xiàn)特征吸收峰圖,而正常鴨胚尿囊液、鴨瘟病毒(DPV)、番鴨細(xì)小病毒(MPV)、鵝細(xì)小病毒(GPV)、H5N1亞型禽流感病毒(AIV)、鴨源新城疫病毒(NDV)、傳染性法氏囊病病毒(IBDV)在DHPLC分析圖譜中未出現(xiàn)與上述一致的特征峰圖。圖1顯示上述幾種毒株的DHPLC分析圖譜,圖中還顯示部分陰性毒株樣品的檢測(cè)圖譜。

圖1 DVHⅠ的PCR-DHPLC特異性檢測(cè)圖譜Fig.1 Specificity of PCR-DHP LC for detecting DHVⅠ

圖2 PCR-DHPLC檢測(cè)DHVⅠ的靈敏度圖譜Fig.2 Sensitivity of PCR-DHPLC for detecting DHVⅠ

2.3 對(duì)人工感染樣品的檢測(cè)

用病原分離,熒光定量PCR及PCR-DHPLC方法分別檢測(cè)人工感染DHVⅠ強(qiáng)毒的櫻桃谷鴨,至10日齡時(shí)全部死亡,死亡雛鴨各臟器檢測(cè)結(jié)果見表2。正常對(duì)照鴨各種檢測(cè)結(jié)果均為陰性。采用PCRDHPLC和病原分離法同時(shí)檢測(cè)517份采集的進(jìn)口鴨棉拭子,檢測(cè)結(jié)果均為陰性,兩種方法對(duì)陰性的符合率為100%(517/517)。

2.4 PCR-DHPLC的敏感性結(jié)果

敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明(圖2),PCR-DHPLC方法最低能檢測(cè)出4 pg的DHV I核酸模板。熒光定量PCR方法同步檢測(cè)DHVⅠ核酸稀釋模板,同樣檢測(cè)低限達(dá)到4 pg(圖3)。

圖3 熒光定量PCR檢測(cè)DHVⅠ的靈敏度圖譜Fig.3 Sensitivity of real-time PCR fo r detecting DHVⅠ

表2 病毒分離、熒光定量PCR和PCR-DHPLC對(duì)DHV I強(qiáng)毒人工感染死亡鴨不同組織的檢測(cè)結(jié)果Table 2 Isolation,real-time PCR and PCR-DHPLC detection results of tissues from dead ducks ex perimentally infected with DHV I

3 討論

DVHⅠ是危害養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴(yán)重的傳染病之一。由于DHVⅠ在自然條件下感染成年鴨后感染者可長期帶毒和排毒而不出現(xiàn)臨床癥狀,但進(jìn)入環(huán)境中的DHVⅠ對(duì)4周齡內(nèi)的雛鴨卻有高致病性,從而導(dǎo)致該病毒在鴨群中廣泛傳播。因此建立檢測(cè)快速、敏感、特異的診斷方法是有效預(yù)防和控制該病的關(guān)鍵措施之一。目前,對(duì)DVHⅠ的診斷主要依靠臨床診斷和病毒的分離鑒定。雖然很多實(shí)驗(yàn)室都對(duì)DHVⅠ的檢測(cè)建立了診斷方法,但仍存在不易標(biāo)準(zhǔn)化,敏感性較低[17]等現(xiàn)象。

本研究針對(duì)DVHⅠ設(shè)計(jì)了特異性引物,建立的PCR-DHPLC診斷方法可對(duì)鴨肝炎病毒進(jìn)行快速診斷,擴(kuò)增的基因片段在變性高效液相色譜中上樣處理,可對(duì)病毒進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別區(qū)分,極大的節(jié)約了時(shí)間和人力。同時(shí),鑒于DVHⅠ可感染不同品種的鴨,亦可感染鵝[18],故本文結(jié)合DVHⅠ感染的生產(chǎn)實(shí)際,對(duì)鴨瘟病毒、番鴨細(xì)小病毒、鵝細(xì)小病毒、H5N1亞型禽流感病毒、鴨源新城疫病毒、傳染性法氏囊病病毒進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果表明,所建立的PCR-DHPLC具有很好的種特異性,此外,由于分離DVHⅠ時(shí)常用雞胚接種,在臨床檢測(cè)時(shí)也多取病變肝臟,故本研究以正常雞胚尿囊液和健康鴨肝臟作為對(duì)照,以取得臨床檢測(cè)的實(shí)際意義。

據(jù)報(bào)道,以倍比稀釋的RNA模板進(jìn)行擴(kuò)增,劉艷萍等[19]建立的 RT-PCR方法最低檢出量為55 pg,程安春等[8]建立的方法最低檢出量為30 pg,而宋永峰等[20]建立的RT-PCR方法檢測(cè)新型鴨病毒性肝炎病毒最低檢出量可達(dá)21 pg。在本研究中,PCR產(chǎn)物經(jīng)DHPLC上樣處理后,最低檢出量可達(dá)4 pg。比普通凝膠電泳檢測(cè)高一個(gè)數(shù)量級(jí),與熒光定量檢測(cè)低限基本一致,可適應(yīng)于出入境檢驗(yàn)檢疫的需要。

雖然在核酸檢測(cè)方面,以熒光PCR方法最為敏感,但成本較高。采用DHPLC技術(shù)可一次自動(dòng)分析數(shù)十甚至數(shù)百個(gè)樣品,實(shí)現(xiàn)了對(duì)核酸分子的高通量自動(dòng)化分析,其特征圖譜可精確到幾個(gè)堿基的差異,不僅避免了常規(guī)PCR電泳檢測(cè)的繁瑣和易造成污染等問題,準(zhǔn)確性也顯著提高,其試劑成本僅相當(dāng)于常規(guī)PCR,在實(shí)際應(yīng)用方面優(yōu)勢(shì)顯著。將DHPLC技術(shù)與核酸擴(kuò)增技術(shù)相結(jié)合建立新型核酸分析手段,在微生物的快速檢測(cè)鑒別等方面也具有很大的開發(fā)應(yīng)用潛力。例如Franciosa G等[21]曾報(bào)道了利用變性高效液相色譜鑒定肉毒桿菌神經(jīng)毒素A、B、E和F型基因的研究,Hurtle W 等[12]利用DHPLC能夠分析rRNA序列變化的特性,建立了鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)和炭疽桿菌(Bacillus anthracis)的特異性吸收譜圖,為微生物鑒定的高通量檢測(cè)提供了新的方法。

本研究采用核酸擴(kuò)增聯(lián)合非變性DHPLC分析方法對(duì)Ⅰ型鴨肝炎病毒建立了PCR-DHPLC鑒別檢測(cè)分析手段。發(fā)揮了變性高效液相色譜技術(shù)在鑒定重大禽類烈性病時(shí)快速、敏感的優(yōu)勢(shì),避免了常規(guī)的病毒分離試驗(yàn)在亞型鑒定時(shí)無法檢測(cè)滴度較低的毒株和出現(xiàn)非特異性交叉現(xiàn)象。在對(duì)采集的人工感染的陽性臨床樣品的檢驗(yàn)中,該法和雞胚病毒分離以及熒光定量PCR方法均表現(xiàn)出很高的符合率,說明建立的方法可以用于微量病毒檢測(cè)。

[1]殷 震,劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)[M].2版.北京:科學(xué)出版社,1997.

[2]Woolcock P R.Duck hepatitis[M].Diseases of Poultry.2003.

[3]Levine P P F J.A hitherto-undescribed virus disease of ducks in No rth America[J].Cornell Vet,1950(40):71-86.

[4]黃顯明,張小飛,魏建忠,等.Ⅰ型鴨病毒性肝炎研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2007,28(11):78-81.

[5]程安春,汪銘書,廖得惠,等.應(yīng)用膠體金免疫電鏡技術(shù)檢測(cè)鴨肝炎病毒[J].中國獸醫(yī)雜志,1994,20(6):3-4.

[6]馬秀麗,宋敏訓(xùn),李 峰,等.Dot-ELISA用于雛鴨病毒性肝炎的診斷[J].山東家禽,2004,3(9):6-8.

[7]Kim M C,Kwon Y K,Joh S J,et al.Development of one-step reverse transcriptase-polymerase chain reaction to detect duck hepatitis virus type 1[J].Avian Dis,2007,51(2):540-545.

[8]程安春,汪銘書,信洪一,等.Ⅰ型鴨病毒性肝炎病毒 RT-PCR檢測(cè)方法的建立[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2007,37(1):38-42.

[9]Choi Y K,Goyal S M,Kang S W,et al.Detection and subtyping of swine influenza H1N1,H1N2 and H3N2 viruses in clinical samples using two multiplex RT-PCR assay s[J].J Virol M eth,2002,102(1-2):53-9.

[10]Taubenberger J K,Layne S P.Diagnosis of influenza virus:coming to grips with the molecular era[J].Mol Diagn,2001,6(4):291-305.

[11]Colosimo A,Guida V,Flex E,et al.U se of DHPLC for rapid screening of recombinant clones[J].Biotechniques,2003,34(4):706-8.

[12]Hurtle W,Shoemaker D,Henchal E,et al.Denaturing HPLC for identifying bacteria[J].Biotechniques,2002,33(2):3868-3901.

[13]Jacinto R C,Gomes B P,Desai M,et al.Bacterial examination of endodontic infections by clonal analy sis in concert with denaturing high-performance liquid chromatography[J].Oral Microbiol Immunol,2007,22(6):403-410.

[14]徐君怡,曹際娟,鄭秋月.變性高效液相色譜檢測(cè)食品中致瀉大腸桿菌[J].微生物學(xué)報(bào),2008,48(11):1526-1531.

[15]Nam Y H,Lee S H,Ahn Y C,et al.[Detection of rifampin resistant mycobacterium tuberculosis complex using denatu-ring HPLC][J].Korean J Lab Med,2008,28(2):95-102.

[16]Saramaki O R,Waltering K K,Visakorpi T.Methods fo r identifying and studying genetic alterations in hormone-dependent cancers[J].Meth Mol Biol,2009,505:263-77.

[17]汪銘書,程安春,陳孝躍.鴨病毒性肝炎的研究——強(qiáng)毒在雛鴨體內(nèi)的分布及排泄[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào),1997,17(3):254-257.

[18]郭玉璞.我國鴨病毒性肝炎研究概況[J].中國獸醫(yī)雜志,1997,23(6):46-48.

[19]劉艷萍,丁春宇,馬學(xué)軍,張大丙.用 RT-PCR檢測(cè)鴨肝炎病毒[J].中國獸醫(yī)雜志,2008,44(4):18-19.

[20]宋永峰,溫納相,宋延華,等.新型鴨病毒性肝炎病毒 RT-PCR檢測(cè)方法的建立[J].中國家禽,2009,31(18):19-21.

[21]F ranciosa G,Pourshaban M,De Luca A,et al.Identification of type A,B,E,and F botulinum neurotoxin genes and of botulinum neurotoxigenic clostridia by denaturing high-performance liquid chromatog raphy[J].Appl Environ Microbiol,2004,70(7):4170-4176.

Establishment of the PCR-DHPLC Method for Identification of Duck Hepatitis Virus TypeⅠ

SUN Tao1,XIAO Xi-zhi1,XU Biao1,LIANG Cheng-zhu1,LING Zong-shuai3,ZHANG Tai-xiang2,YUE Zhi-qin1

(1.Shandong Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Qingdao,Shandong,266002,China;2.Weif ang Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Weif ang,Shandong,261041,China;3.J inan Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Jinan,Shandong,250014,China)

A new molecular method for rapid detection of duck hepatitis virus typeⅠ(DHV Ⅰ)was established by using denaturing high performance liquid chromatography(DHPLC)combined with nucleic acid amplification in this study.According to the sequence of RNA polymerase gene of duck hepatitis virus typeⅠ(DHV Ⅰ),one pair of primers were designed by using Primer Premier 5.0.The PCR fragments were analysised by DHPLC compared to normal duck embryo allantoic fluid,duck plague virus(DPV),muscovy parvovirus(MPV),Avian influenza virus(AIV),Newcastle disease virus(NDV).They were tested to confirm the specificity of the PCR-DHPLC assay and no PCR products were amplified.The sensitivity of the assay DHVⅠwas as low as 4 pg.All results were 100 percent positive when the livers of dead ducks which were experimentally infected with DHVⅠvirulence were detected by the PCR-DHPLC and Real-time PCR.The positive rates by PCR-DHPLC were significantly higher(P≤0.01)than those by the virus isolation when samples were from spleen,lung and brain.T he samples from the ducks experimentally infected with DHVⅠwere tested by PCR-DHPLC and real-time PCR,showing 100%agreement for DHVⅠ.Results showed that the PCR-DHPLC is specific and sensitive,and can be used as a method to detect clinical samples.

Duck hepatitis virus typeⅠ;RT-PCR;denaturing high performance liquid chromatography

S858.32;Q789

A

1007-5038(2011)07-0013-06

2010-12-28

孫 濤(1981-),男,山東萊蕪人,獸醫(yī)師,碩士,主要從事動(dòng)物傳染病病原與生物制品學(xué)研究。