豬血管內皮細胞中分子伴侶Jiv90基因的克隆與原核表達*

楊幼聰,郭抗抗,張彥明,李宇立,張 倩,程媛媛,張三東,彭維剛

(西北農(nóng)林科技大學動醫(yī)學院,陜西楊陵 712100)

豬血管內皮細胞中分子伴侶Jiv90基因的克隆與原核表達*

楊幼聰,郭抗抗,張彥明*,李宇立,張 倩,程媛媛,張三東,彭維剛

(西北農(nóng)林科技大學動醫(yī)學院,陜西楊陵 712100)

克隆到豬Jiv90基因,構建原核表達載體并在大腸埃希菌中表達。從豬血管內皮細胞中克隆到Jiv90基因,將其克隆到pET-32a載體上,構建出重組表達載體,經(jīng)IPTG誘導表達。結果表明,本試驗成功克隆了大小為693 bp的基因,重組質載體pET-32a-Jiv90所表達的蛋白在大腸埃希菌中以包涵體的形式存在,表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Western blot鑒定大小為46 ku,與預期結果一致。為進一步研究該蛋白的功能及制備抗體奠定了基礎。

Jiv90;pET-32a;原核表達

分子伴侶(molecular chaperone)是一類在進化上非常保守的蛋白質家族,是協(xié)助細胞在正常和脅迫條件下保持細胞內穩(wěn)態(tài)的重要蛋白組分,參與許多正常的細胞生理反應過程。它們在反應過程中不與底物結合,不會成為終產(chǎn)物的組成部分[1],而是通過與各類蛋白質非特異性結合,催化蛋白質形成特定的構象,在生物體內起著穩(wěn)定新生蛋白質、輔助其他蛋白質正確折疊、組裝、轉運甚至降解的作用,對蛋白質功能的發(fā)揮具有重要意義[2]。

在復雜的細胞內環(huán)境下,蛋白質的折疊是一個復雜、容易出錯的過程,而病毒由于是細胞內寄生物,在其增殖過程中,需要大量病毒蛋白的翻譯、折疊和運輸?shù)刃揎椷^程。隨著研究的不斷深入,人們發(fā)現(xiàn)分子伴侶在病毒的不同生活周期中都扮演著重要的角色,如病毒的感染、病毒基因組的復制、基因的表達、病毒糖蛋白的折疊與成熟、病毒粒子的裝配等過程中起著非常重要的作用[3-4]。病毒利用分子伴侶,其原因可能是有些病毒在進化過程中為保持其基因組足夠小,因此需要利用伴侶分子幫助其完成復雜的功能。

許多真核、原核宿主的病毒可直接利用宿主細胞中的伴侶分子,或借助宿主細胞編碼病毒的伴侶分子以及一些功能蛋白,以完成病毒增殖的許多相關過程,如流感病毒和水皰性口炎病毒依賴于宿主的分子伴侶進行血凝素以及病毒糖蛋白的折疊、組裝和運輸[5]。分子伴侶參與腫瘤細胞增殖、分化、基質侵染、血管生成、癌細胞轉移以及細胞凋亡等過程。

Lackner T等[6-7]進一步研究發(fā)現(xiàn),在宿主分子伴侶Jiv90的作用下,能將BVDV的NS2-3蛋白切割成NS2、NS3蛋白,NS3蛋白與瘟病毒屬的復制的效率密切相關。細胞中過量表達Jiv90能導致非致細胞病變 BVDV的 RNA量的增加,且能引起CPE;將細胞中的Jiv90表達量下調或是將編碼該蛋白的基因敲除,病毒 RNA及病毒粒子的量都表現(xiàn)出明顯的下調,且無CPE出現(xiàn)。

2006年Lackner等發(fā)現(xiàn),CSFV NS2蛋白與宿主細胞中的分子伴侶Jiv90有兩個結合區(qū)域——JBPⅠ和JBPⅡ,兩者相互作用后NS2蛋白發(fā)揮蛋白酶活性將NS2-3切割為NS2和NS3[8]。2008年Gallei等人將分子伴侶 Jiv90與非致細胞病變型(nCP)強毒株CSFV Alfort-p447構建嵌合病毒Alfort-Jiv90,將后者感染細胞,發(fā)現(xiàn)NS3蛋白和病毒RNA大量增加,同時出現(xiàn)了細胞病變(CPE)。這表明分子伴侶Jiv90能反式調節(jié)NS2-3的自我切割作用[9]。

目前對Jiv90基因的研究只是局限在與病毒的相互作用和對病毒復制的影響,對Jiv90蛋白本身的研究報道較少。本試驗構建Jiv90基因的原核表達載體,并對其表達情況進行了研究,以期為下一步制備Jiv90單克隆抗體提供基礎材料,同時為進一步深入研究Jiv90蛋白的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒和細胞E.coliDH5α、BL21菌株、原核表達載體pET-32a和豬血管內皮細胞,均由本西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院畜禽疫病防治與畜產(chǎn)品安全實驗室保存。

1.1.2 主要工具酶及試劑 限制性內切酶EcoRI、BamHⅠ、T4DNA連接酶以及PCR反應試劑、膠回收試劑盒反轉錄試劑盒等購自寶生物工程(大連)有限公司;總RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 基于已發(fā)表的牛Jiv基因序列,利用Primer軟件設計1對特異性引物,上、下游引物5′端分別引入了EcoRⅠ和HindⅢ限制性酶切位點(下劃線部分)。上下游引物 P1:5′-CGGAATTCCAGCTGGCAGTGATGGT TCAT-3′;P2:5′-ATCAAGCT TT TTACTTCCGCCGCT TCGGTTTA-3′引物由南京金斯瑞生物科技公司合成。

1.2.2 RT-PCR反應 胰酶消化豬血管內皮細胞后收集細胞培養(yǎng)物,用總 RNA提取試驗盒提取總RNA。以RNA為模板使用反轉錄試劑盒得到cDNA,以反轉錄得到的cDNA為模板,以模板,用特異性引物P1和P2進行擴增。反應條件為:95℃5 min;95℃30 s,63℃40 s,72℃30 s,共35個循環(huán);72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.3 原核重組表達質粒pET-32a的構建及鑒定將目的基因進行PCR擴增、回收后,與pET-32a表達載體分別用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切,然后用T4 DNA連接酶連接,轉化到DH5α感受態(tài)細胞中,挑取白色單克隆于含氨芐霉素抗性的LB培養(yǎng)液中37℃振蕩過夜,提取質粒進行酶切及測序鑒定。

1.2.4 Jiv90基因在大腸埃希菌中的表達 將pET-32a-Jiv90轉化到感受態(tài)大腸埃希菌BL21,涂布于含Amp+(100 μ g/mL)的 LB平板上,37 ℃培養(yǎng)過夜,次日挑取單菌落,于5 mL LB液體培養(yǎng)基中,37℃搖床振蕩(200 r/min)培養(yǎng)過夜。

1.2.5 Jiv90蛋白的誘導表達與可溶性分析

1.2.5.1 不同濃度的IPTG對JIV90蛋白的誘導表達分析 將菌液按 1∶100接種于6 mL含有Amp+100 μ g/mL)抗生素的 LB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6時,加入IPTG至終濃度分別為 0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、0.75 mmol/L、1.0 mmol/L,37 ℃誘導表達 4 h～5 h,收獲細菌,然后進行SDS-PA GE分析。

1.2.5.2 不同時間對Jiv90蛋白的誘導表達分析將凍存菌液按1∶100擴大接種于6 mL含有Amp+(100μ g/mL)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6時,加入IPTG至終濃度 0.25 mmol/L,37 ℃誘導表達 2 、3、4、5、6、7 h,收獲細菌,然后進行SDS-PA GE分析。

1.2.5.3 Jiv90蛋白表達產(chǎn)物的可溶性分析將凍存菌液按1∶100擴大接種于6 mL含有Amp+(100 μ g/mL)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6時,加入IPTG至終濃度0.5 mmol/L,37℃誘導表達7 h,收獲細菌,以 PBS重懸菌體,超聲破菌。分別收集上清和沉淀,取上述各樣品做SDS-PA GE電泳檢測表達情況。

1.2.6 融合蛋白pET-32a-Jiv90蛋白Western blot檢測 表達蛋白的電泳同1.5節(jié)。電泳結束后用Bio-rad電轉移裝置將其轉印于PVDF膜上(半干轉膜法100 V,1.5 h),轉印結束后,按常規(guī)方法進行Western blot,一抗為鼠源抗HIS標簽的抗體(1∶3 000倍稀釋),二抗為辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG(體積比1∶4 000倍稀釋),最后用DAB顯色。

2 結果

2.1 Jiv90基因的PCR擴增

擴增出長度約為693 bp的1條帶(圖1),與預期的基因片段長度相符。

2.2 重組原核表達載體

pET-32a-Jiv90的鑒定重組原核表達載體pET-32a-Jv90經(jīng)限制性內切酶EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定結果如下,切出了5 900 bp和693 bp的片段,與預期大小相符。將酶切鑒定正確的陽性菌株送至南京金斯瑞生物科技公司測序。結果表明,序列完全正確,無突變,無缺失。

2.3 不同濃度PTG對JIV90蛋白的誘導表達分析

加入 IPTG 至終濃度分別為 1.0、0.75、0.5、0.25 mmol/L,37℃誘導表達4 h收菌,然后進行SDS-PA GE分析?？梢娀蚬こ叹T導0.25 mmol/L后目的蛋白的表達量達高峰(圖3)。

2.4 不同時間對Jiv90蛋白的誘導表達分析

加入IPTG至終濃度0.25 mmol/L,37℃誘導表達 2、3、4、5、6、7 h 后收獲細菌,然后進行SDSPA GE分析發(fā)現(xiàn)基因工程菌誘導7 h后目的蛋白的表達量達高峰。

2.5 Jiv90蛋白的可溶性分析

重組質粒經(jīng)IPTG誘導后分別收集上清和沉淀,經(jīng)SDS-PA GE檢測,融和蛋白主要以上清形式存在(圖4)。

圖1 Jiv90基因PCR擴增電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR products for part of Jiv90

2.6 融合蛋白pET-32a-Jiv90蛋白的Western blot檢測

Western blot檢測結果見圖5,印跡分析中在約46 ku處有一條帶出現(xiàn),表明原核系統(tǒng)表達獲得Jiv90蛋白。

圖2 重組質粒EcoR I和 HindIII雙酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid by EcoRⅠ and HindⅢ

圖3 SDS-PAGE檢測 pET-32 a-Jiv 90的表達Fig.3 Detection of pET-32a-Jiv 90 ex pression by SDS-PAGE

圖4 Jiv90蛋白的可溶性分析Fig.4 Solubility analysis of Jiv90 protein

3 討論

細胞內蛋白質的折疊是一個復雜、易于出錯的過程。病毒是細胞內寄生物,在其增殖過程中,伴隨著大量病毒蛋白的折疊、裝配和定向分配等修飾過程,盡管許多病毒蛋白具有復雜的三級、四級結構,但是它們仍能在宿主細胞中迅速有效地折疊、裝配成適合的構象。人們發(fā)現(xiàn)分子伴侶在病毒的不同生活周期中如病毒的感染、病毒基因組的復制、基因的表達、病毒糖蛋白的折疊與成熟、病毒粒子的裝配等過程中起著非常重要的作用。許多真核、原核宿主的病毒可直接利用宿主細胞中的伴侶分子,或借助宿主細胞編碼病毒的伴侶分子以及一些功能蛋白,以完成病毒增殖的許多相關過程。

Jiv90蛋白已經(jīng)證明與CSFV的復制有關,而現(xiàn)有的研究都集中在Jiv90蛋白與病毒的相互作用上,而對該蛋白的研究較少,為了進一步能夠研究Jiv90蛋白的功能,例如,機體是怎樣調節(jié)Jiv90的量與NS2相互作用來調節(jié)病毒的復制與病毒的量,Jiv90蛋白是通過什么途徑降解的?Jiv90蛋白的拓撲異構學如何?能否引起內質網(wǎng)應急效應?對Jiv90的量影響病毒的復制,接毒后病毒是否影響Jiv90的表達?Jiv90蛋白是否對細胞周期和凋亡有影響?這些問題的解決均需要Jiv90的單克隆抗體,而市場上沒有商品化的抗體,然而原核表達是制備抗體的必須階段。只有對原核表達情況進行了解后才能為制備抗體奠定基礎。在試驗過程中發(fā)現(xiàn)Jiv90蛋白對一般的BL21感受態(tài)菌體有毒性不能夠表達Jiv90,最后用BL21(DE3)pLys這種感受態(tài)菌體才能誘導Jiv90蛋白表達,通過Western blot證明表達的蛋白為目的蛋白,并且誘導的Jiv90蛋白以包涵體形式存在。

圖5 pET-32a-Jiv90重組蛋白 Western blot檢測Fig.5 Western blot detection of fusion protein pET-32a-Jiv90

[1]Hartl F U.Molecular chaperones in cellular protein folding[J].Nature,1996,381(6583):571-579.

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Cloning and Prokaryotic Expression of Molecular Chaperone Jiv90 Gene from Swine Umbilical Vein Endothelial Cells

YANG You-cong,GUO Kang-kang,ZHANG Yan-ming,LI Yu-li,ZHANG Qian,CHENG Yuan-yuan,ZHANG San-dong,PENG Wei-gang

(Colleage of Veterinary Medicine,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi712100,China)

The research studied the cloning and expression of Jiv90 gene.693 bp of Jiv90 gene from swine vein endothelia cell was amplified by PCR,and cloned into prokaryotic expression vector pET-32a,and expressed inE.coliBL21(DE3).The target protein was expressed inE.coliBL21(DE3)induced with IPTG,and detected by SDS-PAGE and Western blot.The results indicated that the 46 ku expressed protein could be recognized by mouse antiHis-tag antibody.The results laid the foundation for studies on the protein function and the preparation of antibodies.

pET-32a;Jiv90 gene;prokaryotic expression

S852.21;Q786

A

1007-5038(2011)07-0009-05

2011-05-18

國家轉基因生物新品種培育重大專項—抗病轉基因新品種培育(2009ZX08006-006B);陜西省“13115”科技創(chuàng)新工程重大科技專項—豬瘟病毒致病機理與抗病育種研究(2009ZDKG-23)

楊幼聰(1984-),男,河北邢臺人,碩士研究生,主要從事分子病原學與免疫學研究。*通訊作者