合用氟喹諾酮類藥物對金黃色葡萄球菌突變選擇窗的影響

江 玲，王慧玲，庚俐莉，劉春芳

(1.大連市中心醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，遼寧 大連 116033；2.大連醫(yī)科大學 附屬第二醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，遼寧 大連 116027)

氟喹諾酮類藥物(fluroquinolones，F(xiàn)Qs)是最重要最常用的抗菌藥物之一。但隨著FQ藥物的廣泛使用，在抗菌藥物的選擇壓力下，細菌不斷發(fā)生耐藥性變異，以求適者生存。盡管人們對FQ藥物的耐藥機制進行了大量的研究，并從藥物治療及藥物研究方面做了大量的工作，但細菌耐藥問題仍變得越來越嚴重。其中，部分原因是由于目前基于最低抑菌濃度(MIC)的治療濃度，僅阻止大部分敏感菌的生長，而使耐藥突變菌株得到選擇性富集擴增。Drlica 等[1,2]提出的防突變濃度(mutant prevention concentration，MPC)概念和突變選擇窗(mutant selection window，MSW)理論既著眼于控制感染，又考慮到藥物的限制耐藥突變能力，為研究FQ耐藥機制開辟了新領域，并且基于此理論提出了不同作用機制藥物聯(lián)合應用縮小甚至關閉MSW，為減少細菌耐藥提供了新的有效途徑和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 細菌：實驗菌株來自于大連市中心醫(yī)院2008年1～8月住院患者痰及分泌物標本中分離的金黃色葡萄球菌。選擇苯唑西林和環(huán)丙沙星敏感菌株38株，金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC25923為質控菌株，購自中國藥品生物制品檢定所。

1.1.2 培養(yǎng)基及儀器：Muller-Hinton(M-H)瓊脂、M-H肉湯購自法國生物梅里埃公司。

1.1.3 抗菌藥物：抗菌藥物標準品左氧氟沙星(Levofloxacin，LVF；效價97.2%)、頭孢唑啉(Cefazolin，CFZ；效價99.2%)購自中國藥品生物制品檢定所；莫西沙星(Moxifloxacin，MXF；400 mg/250 mL)購自德國拜耳制藥公司。

1.1.4 藥敏紙片：環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)、頭孢西丁(Cefoxitin，F(xiàn)OX)購自英國OXOID公司。

1.2 方 法

1.2.1 細菌分離鑒定：常規(guī)分離臨床標本并經(jīng)API系統(tǒng)鑒定。

1.2.2 藥物敏感性測定：采用K-B紙片擴散法測定金黃色葡萄球菌對環(huán)丙沙星和頭孢西丁敏感性。藥敏判定標準按2006年美國臨床實驗室標準化研究所(CLSI)標準判讀。環(huán)丙沙星抑菌圈直徑≥21 mm、頭孢西丁抑菌圈直徑≥20 mm為敏感菌。標準菌株ATCC25923為質控菌株。

1.2.3 MIC測定：采用標準瓊脂二倍稀釋法測定LVF、MXF的MIC，藥敏結果按2006年CLSI標準。

1.2.4 FQ藥物瓊脂平板的配置：含單藥瓊脂平板的配置：按各菌株MIC測定結果，用倍比稀釋法配置10個濃度梯度的含藥MH瓊脂平板，平板的最低濃度相當于該菌株的MIC，每個濃度4個平板。

含兩藥瓊脂平板的配置[3]：以LVF和MXF的MIC、MPC為基準，采用倍比稀釋法配置含LVF+CFZ，MXF+CFZ的M-H瓊脂平板。其中，CFZ的藥物濃度為各菌株的MIC,聯(lián)合LVF或MXF的藥物濃度分別為各菌株的1×MIC、2×MIC、4×MIC、8×MIC、16×MIC、32×MIC。

1.2.5 MPC測定：用肉湯富集后菌液濃度調(diào)整為3×1010CFU/mL。分別取菌液100 μL均勻涂抹在每個含有倍比稀釋濃度的單藥及含兩藥的抗菌藥物瓊脂平板上。于35℃孵育，72 h沒有菌落生長的最低藥物濃度為MPC。結合文獻，確定用于MPC測定所用抗菌藥物的濃度系列，結果超出濃度系列的再次加大范圍。對接近MPC的菌株，傳代兩次后再接種于原MPC的平皿上，若菌株生長，可確保是耐藥突變株。

1.3 統(tǒng)計學方法

根據(jù)MIC及MPC結果，計算MIC50(藥物對50%菌株的MIC)、MIC90(藥物對90%菌株的MIC)、MPC50、MPC90、MPC/MIC[選擇指數(shù)(SI)]。用SPSS11.5統(tǒng)計軟件包中配對t檢驗的統(tǒng)計學方法進行統(tǒng)計學分析，以P<0.05為差異有顯著性意義。

2 結 果

2.1 MIC

LVF、MXF對臨床分離的38株金黃色葡萄球菌的MIC值，見表1。CFZ的MIC范圍在0.125～1 mg/L。

表1 兩種FQ對38株金黃色葡萄球菌的MIC

2.2 MPC分布

兩種FQ對38株臨床分離金黃色葡萄球菌的MPC分布，見表2及圖1。

圖1 38株金黃色葡萄球菌FQ單藥及聯(lián)合用藥MPC值分布圖

2.3 MPC和SI的比較

兩種FQ單藥及聯(lián)合用藥對38株臨床分離金黃色葡萄球菌的MPC50、MPC90、MPC50/MIC50、MPC90/MIC90，見表2。

LVF聯(lián)合CFZ后對38株金黃色葡萄球菌的MPC90下降到8 mg/L；MXF聯(lián)合CFZ后MPC90下降到0.5 mg/L。t檢驗P<0.05，差異具有顯著性意義。

LVF聯(lián)合CFZ后對38株臨床分離金黃色葡萄球菌的MPC50/MIC50、MPC90/MIC90分別為2和8；MXF聯(lián)合CFZ后的MPC50/MIC50、MPC90/MIC90各值均為1，t檢驗P<0.05，差異具有顯著性意義。

表2 FQ與CFZ聯(lián)合前后MPC和SI

3 討 論

美國國立衛(wèi)生院的Zhao和Drlica等[1,2]基于多次實驗中的發(fā)現(xiàn)，提出了MPC概念以及MSW理論，在以改變用藥劑量或方法為特征的新的治療策略中提出了一些新的理論依據(jù)[4]。MSW理論認為，只有藥物濃度在病原菌的MIC和MPC之間時，耐藥突變菌株才會被選擇性富集擴增，從而導致耐藥。當藥物濃度低于MIC或者高于MPC時，不會導致細菌的耐藥?；贛SW理論，在治療中可以通過選擇窄MSW、低MPC的理想藥物，來達到防止細菌耐藥產(chǎn)生的作用。但實際上，大多數(shù)藥物很難獲得血清或組織液的藥物濃度超過MPC，且即使達到，往往也會帶來機體的嚴重毒性反應。本實驗顯示，LVF對臨床分離金黃色葡萄球菌的MPC是MIC的16倍。只有增大劑量，才有可能達到這樣的濃度。大劑量的LVF可能導致癲癇、肌腱斷裂及心血管等嚴重不良事件的發(fā)生。另外，對于傳統(tǒng)的FQ選擇產(chǎn)生的第一步突變耐藥菌株，新一代FQ對此突變菌株的MSW明顯增大，易產(chǎn)生雙酶突變導致新的耐藥[5-8]。

根據(jù)MSW理論基礎還可以通過選擇作用機制不同的藥物聯(lián)合，以縮小甚至關閉MSW[2]。本實驗通過比較LVF、MXF單用和與CFZ聯(lián)用對臨床分離金黃色葡萄球菌的SI，結果顯示聯(lián)合CFZ后LVF和MXF的SI均較單藥明顯降低，LVF從16降到了8，MXF從4降到了1。聯(lián)合用藥縮小了LVF對金黃

色葡萄球菌的MSW，關閉了MXF對金黃色葡萄球菌的MSW。其原因是由于當作用機制不同的兩種藥物聯(lián)合，其濃度同時處于各自的MIC之上時，細菌需要同時發(fā)生兩種突變才能允許耐藥突變菌株的富集(而這種突變的可能性很小)。不同作用部位的藥物的聯(lián)合提供了一種縮小甚至關閉MSW的途徑，即使這些藥物各自都有非常高的MPC。本實驗結果與國內(nèi)外文獻報道一致[3,9-11]。本研究結果中聯(lián)合用藥能夠縮小LVF的MSW，但其MPC 8 mg/L仍略高于血藥峰濃度[12]( LVF 500 mg,qd,Cmax為7.6 mg/L)。常規(guī)用藥時，藥物濃度仍落在MSW內(nèi)。分析減少耐藥產(chǎn)生的原因，可能是突變株雖有選擇性富集，但由于CFZ對LVF的第一步突變菌株具有殺菌活性，減少了富集擴增的突變菌株數(shù)目，從而降低了細菌耐藥的發(fā)生率。還有一種可能是聯(lián)合用藥后LVF的MPC可以低于其血藥峰濃度，從而減少藥物濃度落入突變選擇窗的時間，降低細菌耐藥的發(fā)生率。但本研究細菌菌株數(shù)較少，還需擴大菌株數(shù)量進一步研究。

隨著抗菌藥物對病原體MPC，MSW的研究深入，臨床治療中，可以通過合理的使用現(xiàn)有抗菌藥物聯(lián)合治療，縮小或關閉藥物的MSW，在有效治療的同時，阻止或延緩細菌對抗菌藥物的耐藥。新的、高效的抗菌藥物可以通過聯(lián)合其他藥物使用來防止新的抗菌藥物迅速失效。由于體內(nèi)藥物處于動態(tài)變化之中，如何使聯(lián)合藥物藥代動力學相匹配，如何選擇聯(lián)合藥物的種類尚需進一步的研究。

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