金雀異黃素對CIA大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖、凋亡及其機制的研究

張 育，張學(xué)增，沈維干，許金鑫，馬瑩瑩

(1.江蘇揚州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇揚州 225001;2.山東青島衛(wèi)生學(xué)校，山東 青島 266071)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種常見的可致殘的慢性炎癥性疾病，其最主要的病理表現(xiàn)為滑膜炎，滑膜細(xì)胞呈腫瘤細(xì)胞樣增殖并產(chǎn)生多種炎癥因子，如IL-1和TNF-α等。金雀異黃素(Genistein，Gen)又稱為染料木素，是一種來源于豆類植物和齒類植物異黃酮類化合物，其化學(xué)名為4，5，7-三羥基異黃酮。體外實驗研究表明Gen可能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，故Gen已經(jīng)成為廣受各界關(guān)注的一種非營養(yǎng)素成分［1-2］。AKT又被稱為蛋白激酶 B(protein kinase B，PKB)，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是PI3K/AKT信號傳導(dǎo)通路中的關(guān)鍵分子。磷酸化的AKT誘發(fā)的細(xì)胞生長，經(jīng)多種途徑促進(jìn)細(xì)胞存活，是重要的抗凋亡調(diào)節(jié)因子［3］。近來許多研究表明［4-5］，炎癥因子能夠通過活化AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化多種炎性細(xì)胞，參與RA疾病的發(fā)生與發(fā)展。我們采用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，擬研究Gen對CIA大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞中AKT及其磷酸化蛋白p-AKT表達(dá)的影響，探討Gen調(diào)節(jié)CIA大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖、凋亡蛋白表達(dá)與其影響AKT表達(dá)和磷酸化蛋白p-AKT表達(dá)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1實驗細(xì)胞來源用Ⅱ型膠原建立CIA大鼠動物模型，取滑膜細(xì)胞原代培養(yǎng)，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測第4代細(xì)胞純度達(dá)到頂峰，故用第4代細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.2實驗試劑和藥物Gen購自Sigma公司(相對分子質(zhì)量為270.2，純度不低于99%);小牛血清購自杭州四季青公司;DMEM培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司;二甲基亞砜(DMSO)購自上海生工生物工程有限公司;5×loading buffer購自南通碧云天生物公司;Rabbit Anti-bax和Rabbit Anti-bcl-2抗體購自美國eBioscience公司;AKT單克隆抗體、p-AKT多克隆抗購自美國Santa Cruz公司;辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗小鼠二抗、兔抗小鼠二抗及DAB顯色液為武漢博士德生物工程有限公司的產(chǎn)品;小鼠抗大鼠GAPDH購自北京博奧森生物科技有限公司。其余試劑均為進(jìn)口分裝或市售分析純。

1.3實驗方法

1.3.1CIA大鼠FLS的培養(yǎng)CIA大鼠FLS養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)液(含15%小牛血清，100 kU·L-1青霉素，100 g·L-1鏈霉素)中。上述細(xì)胞均放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。2～3 d換液1次。取第4代對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.3.2大鼠FLS的鑒定用流式細(xì)胞術(shù)檢測CIA大鼠FLS表面標(biāo)記VCAM-1，觀測細(xì)胞的純度。

1.3.3實驗分組實驗分為正常大鼠FLS組、CIA大鼠FLS組、CIA大鼠FLS+DMSO(濃度為0.1%)組、CIA大鼠FLS+不同濃度的Gen(濃度分別為50、100、200 μmol·L-1)組。

1.3.4MTT法檢測Gen抑制FLS增殖情況接種細(xì)胞:用0.25%胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的CIA大鼠FLS以及正常大鼠FLS，用含15%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，計數(shù)后分別接種于96孔培養(yǎng)板，每孔約5 000個細(xì)胞，設(shè)6個復(fù)孔。將培養(yǎng)板移入細(xì)胞培養(yǎng)箱中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，CIA大鼠FLS組分別加入不同濃度Gen，使其終濃度分別為0、50、100、200 μmol·L-1。分別培養(yǎng)24、48和72 h后，每孔加入20 μl MTT溶液(5 g·L-1)，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，終止培養(yǎng)。棄上清，每孔分別加入50 μl DMSO，輕輕振蕩10 min，充分溶解結(jié)晶。酶標(biāo)儀(波長490 nm)測定各孔的OD值，記錄結(jié)果，實驗重復(fù)3次。

1.3.5Western blot法檢測Gen對CIA大鼠關(guān)節(jié)FLS bcl-2和bax表達(dá)的影響用0.25%胰蛋白酶消化對數(shù)生長期CIA大鼠FLS以及正常大鼠FLS，用含15%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成單個細(xì)胞懸液，接種于?10 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿。按以上分組進(jìn)行加藥，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72 h后，終止培養(yǎng)。重懸計數(shù)，移入1.5 ml EP管，離心棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次。離心去上清，將EP管口倒置于吸水紙上吸干殘留液體。按5×106個細(xì)胞加入0.1 ml RIPA強裂解液，并劇烈振蕩后置冰上120 min〔裂解液在使用前按每毫升加入10 μl PMSF(100 mmol·L-1)配制，冰浴預(yù)冷后使用〕。4℃ 12 000 r·min-1離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移至另一1.5 ml EP管中。每個樣本中各取少量蛋白，通過BCA法測定蛋白樣品濃度，并將蛋白樣品濃度調(diào)成一致，每組取50 μg的總蛋白按1∶4加入5×SDS上樣緩沖液沸水浴中加熱5 min，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，0.3%的 BSA封閉1 h加入bax、bcl-2和內(nèi)參GAPDH抗體4℃孵育過夜。TBST洗滌3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，37℃與膜孵育1 h，TBST洗滌3次，DAB顯色液A、B、C液各一滴加入1 ml三蒸水中混勻取1 ml將膜浸與其中5 min流水沖洗。掃描后用Quantity One灰度分析軟件進(jìn)行光密度計算。以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值作為相應(yīng)目的蛋白的表達(dá)量指標(biāo)。每個樣本至少重復(fù)3次。

1.3.6Western blot法檢測Gen對CIA大鼠滑F(xiàn)LS AKT及p-AKT表達(dá)的影響細(xì)胞分組及處理如“1.3.5”所述。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理所有統(tǒng)計學(xué)處理均在SPSS10.0、Excel 2003 軟件中完成。

2 結(jié)果

2.1滑膜細(xì)胞的形態(tài)及鑒定對原代培養(yǎng)的FLS進(jìn)行貼壁分離純化，細(xì)胞培養(yǎng)成功，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)果見Fig 1，從圖中可以看到兩種形態(tài)細(xì)胞:長梭行及多角形，F(xiàn)LS常呈單個排列。培養(yǎng)3～4 d后平鋪貼壁生長。對CIA大鼠FLS進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)鑒別結(jié)果顯示如Fig 2。

Fig 1 Morphology of primary cultured rat fibroblast–like synoviocytes(×400)

Fig 2 Detection of VCAM-1 on CIA rat fibroblast-like synoviocytes by flow cytometry

2.2MTT法檢測Gen抑制細(xì)胞增殖為了觀察Gen對大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖的影響，本研究MTT的方法分檢測24，48和72 h 3個時間點細(xì)胞增殖情況，細(xì)胞增殖結(jié)果由Tab 1可見，造模后CIA大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖程度明顯高于正常組大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞，50、100 和 200 μmol·L-1的Gen均可以抑制CIA大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖，差異有顯著性(P＜0.01)，且成劑量時間依賴性關(guān)系，DMSO對CIA大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖無影響。結(jié)果見Tab 1。

Tab 1 Gen-suppressed FCS proliferation by MTT assay(±s，n=6)

Tab 1 Gen-suppressed FCS proliferation by MTT assay(±s，n=6)

A is the synovial cells of CIA rats and the other results is the multiples of A，*P ＜0.01

Group Dose/μmol·L-1 Absorbance 24 h 48 h 72 h Synovial cells of normal rats - - 0.82 ±0.024* 0.97 ±0.021* 1.36 ±0.062 DMSO/%*A 1.00 ±0.036 1.35 ±0.01 2.12 ±0.031 A+DMSO - 0.1 1.00 ±0.055 1.35 ±0.023 2.13 ±0.133 A+gen 1 50 ≤0.1 0.87 ±0.036* 1.14 ±0.024* 1.67 ±0.124*A+gen 2 100 ≤0.1 0.83 ±0.013* 1.01 ±0.023* 1.40 ±0.063*A+gen 3 200 0.1 0.79 ±0.041* 0.89 ±0.029* 1.10 ±0.04--*

2.3Western blot法檢測Gen對CIA大鼠關(guān)節(jié)FLS bcl-2和bax表達(dá)的影響B(tài)cl-2家族多定位于線粒體外膜、核膜以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的胞漿面，分為促凋亡蛋白(bax)和抗凋亡蛋白(bcl-2)，不同濃度的Gen作用FLS細(xì)胞72 h后，提取FLS細(xì)胞總蛋白，采用Western blot檢測上述分子的變化。結(jié)果如Fig 3所示:①與正常組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)FLS細(xì)胞bax蛋白表達(dá)水平明顯降低，而模型組大鼠關(guān)節(jié)FLS細(xì)胞bcl-2蛋白表達(dá)水平較正常組大鼠關(guān)節(jié)FLS細(xì)胞明顯增高，差異均有顯著性(P＜0.05);用藥組bax表達(dá)量均低于正常組，其中Gen1和Gen2與正常組差異有顯著性(P＜0.05)，Gen3組bax表達(dá)量接近于正常組(P＞0.05);Gen1和Gen2組bcl-2表達(dá)高于正常組，其Gen2與正常組比較差異有顯著性(P＜0.05)，高劑量組bcl-2表達(dá)低于正常組，差異有顯著性(P＜0.05)。②與模型組比較，不同濃度的Gen作用細(xì)胞后，隨著藥物濃度的增加，與模型組比較bax蛋白表達(dá)均有不同水平的上調(diào)，其中Gen2組和Gen3組與模型組比較差異有顯著性(P＜0.05)，Gen1組與模型組比較差異無顯著性(P＞0.05);用藥組bcl-2蛋白表達(dá)均有不同水平的下調(diào)，與模型組比較差異均有顯著性(P＜0.05)。

Fig 3 Expression of bax，bcl-2，β-actin in rat FLS

Fig 4 Expression of AKT，AKT in rat FLS

2.4Western blot法檢測Gen對CIA大鼠FLS中AKT及p-AKT表達(dá)的影響不同濃度Gen作用CIA大鼠關(guān)節(jié)FLS 72 h后AKT、p-AKT表達(dá)的高低，結(jié)果如Fig 4所示:①與正常組比較，造模組及用藥組AKT表達(dá)量均無差異(P＞0.05);造模組p-AKT表達(dá)量高于正常組，且差異有顯著性(P＜0.05);各Gen用藥組p-AKT蛋白的表達(dá)均高于正常組，Gen1和Gen2組與正常組比較差異有顯著性(P＜0.05)，Gen3組與正常組p-AKT表達(dá)相當(dāng)(P＞0.05)。②與模型組比較，各用藥組AKT表達(dá)無差異(P＞0.05);不同濃度Gen用藥組p-AKT蛋白的表達(dá)均低于模型組，差異均有顯著性(P＜0.05)，且p-AKT表達(dá)的降低與Gen呈劑量依賴性。

3 討論

Gen是大豆異黃酮的主要活性成分，是一種天然植物雌激素，長期以來引起人們廣泛的關(guān)注。1987年Akiyama等首次發(fā)現(xiàn)Gen是一種受體酪氨酸激酶(RTK)抑制劑，可以抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的增殖［6-7］，體內(nèi)外實驗及流行病學(xué)結(jié)果均顯示，Gen通過抑制腫瘤細(xì)胞周期蛋白表達(dá)、誘導(dǎo)細(xì)胞分化、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用［8］。

RA患者的FLS呈腫瘤細(xì)胞樣生長，即表現(xiàn)為異常增殖、凋亡受阻并產(chǎn)生大量的炎性細(xì)胞因子，因此，F(xiàn)LS作為一個治療 RA的靶點已受到廣泛關(guān)注［9］。FLS在RA的發(fā)病過程、慢性炎癥的維持和軟骨與骨的破壞等方面發(fā)揮著重要的作用，因此我們研究FLS的生物學(xué)功能對于探討RA的發(fā)病機制及篩選抗RA藥物具有重要意義。VCAM-1是目前常用的鑒別FLS的特異性的標(biāo)記物之一［10］。我們用流式法檢測培養(yǎng)的原代滑膜細(xì)胞表面VCAM-1的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)的原代滑膜細(xì)胞VCAM-1的表達(dá)在第1代約20%，第2代約50%左右，培養(yǎng)至3代約為70%，第4代的細(xì)胞VCAM-1的表達(dá)為85.5%，第4代的滑膜細(xì)胞中大部分為FLS，與資料報道結(jié)果一致。故我們選取第四代FLS做為研究對象進(jìn)行實驗研究。

作為bcl-2家族中一對凋亡相關(guān)基因，bcl-2/bax的平衡在細(xì)胞的凋亡過程中起重要調(diào)節(jié)作用，在細(xì)胞線粒體中，bcl-2家族蛋白通過與其他凋亡蛋白的相互協(xié)同作用，調(diào)控線粒體的結(jié)構(gòu)與功能，發(fā)揮著細(xì)胞凋亡主開關(guān)的作用。bcl-2家族蛋白在凋亡中的主要功能就是直接調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性，從而調(diào)節(jié)不同凋亡因子的釋放過程，發(fā)揮其抗凋亡或促凋亡作用。bax是bcl-2家族中的促凋亡基因，其高表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而bcl-2是一種原癌基因，其高表達(dá)可以抑制細(xì)胞的凋亡過程。我們采用Western blot方法檢測Gen對CIA大鼠關(guān)節(jié)FLS凋亡蛋白表達(dá)是否有影響，研究結(jié)果顯示，Gen能夠調(diào)節(jié)CIA大鼠關(guān)節(jié)FLS凋亡蛋白bcl-2和bax的表達(dá)，用藥后CIA大鼠關(guān)節(jié)FLS凋亡調(diào)節(jié)蛋白bcl-2表達(dá)降低，而bax表達(dá)升高，且隨Gen劑量的增大，其作用增強，提示Gen在抑制細(xì)胞增殖同時能夠誘導(dǎo)CIA大鼠關(guān)節(jié)FLS的凋亡，進(jìn)一步加強了對FLS增殖的抑制作用。

信號途徑是重要的細(xì)胞調(diào)控通路，各種影響因素及細(xì)胞因子均是通過不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)功能，如細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移等一系列過程，目前已知PI3K/AKT在細(xì)胞增殖、凋亡、遷移以及血管新生等相關(guān)過程中，起重要的作用［11-12］。RA發(fā)生后，機體的多種免疫細(xì)胞被激活，并產(chǎn)生大量的炎性細(xì)胞因子，炎癥因子與相應(yīng)的細(xì)胞表面受體結(jié)合后，可分別激活不同的信號通路，將刺激信號傳到細(xì)胞核，從而調(diào)控細(xì)胞各種生物學(xué)功能的發(fā)生。

Gen作為受體酪氨酸激酶抑制劑，對多種癌細(xì)胞有抑制生長和刺激分化并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用［13-14］。同時Gen作為受體酪氨酸激酶抑制劑影響腫瘤細(xì)胞PI3K/AKT信號通路［15］。為進(jìn)一步探討CIA大鼠關(guān)節(jié)FLS異常增殖及凋亡受阻的生物學(xué)機制及Gen對CIA大鼠關(guān)節(jié)FLS凋亡的影響機制，我們從細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路水平進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，發(fā)現(xiàn)造模后的CIA大鼠關(guān)節(jié)FLS p-AKT表達(dá)量明顯增高，結(jié)合凋亡蛋白Western blot結(jié)果，由此推斷，造模后CIA大鼠關(guān)節(jié)FLS在自分泌或旁分泌細(xì)胞因子的作用下，其PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被異?；罨?，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡受阻。Gen對CIA大鼠關(guān)節(jié)FLS PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中AKT的表達(dá)無明顯影響，但Gen能夠降低AKT磷酸化形式p-AKT的表達(dá)量，從而調(diào)節(jié)其下游的生物學(xué)功能，如細(xì)胞的增殖、細(xì)胞的凋亡及細(xì)胞因子的產(chǎn)生。我們認(rèn)為Gen能夠通過調(diào)節(jié)FLS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)一步調(diào)節(jié)凋亡蛋白表達(dá)。目前學(xué)術(shù)界理論認(rèn)為，RA患者FLS存在PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的異常活化，參與RA炎癥細(xì)胞的活化及異常增殖，同時，PI3K/AKT信號通路活化后具有明顯的抗細(xì)胞凋亡作用，而在RA患者滑膜組織中，F(xiàn)LS呈過度增殖并且表現(xiàn)凋亡受阻等腫瘤細(xì)胞增殖的特性，有實驗表明，PI3K的抑制劑wortmannin和LY294002能夠誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，阻滯細(xì)胞周期在G1期，導(dǎo)致細(xì)胞生長停滯［16］，此結(jié)論與本研究結(jié)果相一致。

總之，AKT可能成為RA治療的一個新靶點，研究結(jié)果表明，抑制p-AKT的表達(dá)可能是Gen調(diào)節(jié)CIA大鼠FLS凋亡蛋白表達(dá)的原因之一，因此Gen可能是未來治療RA的有效措施之一。

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