帕金森病小鼠和大鼠模型黑質(zhì)紋狀體中膽綠素還原酶B的表達(dá)

周冰瑩，趙 欣，孫 泓，姜 堯，蒲小平

(北京大學(xué)1.天然藥物與仿生藥物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、2.藥學(xué)院分子與細(xì)胞藥理學(xué)系，北京 100191)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種由于黑質(zhì)部位多巴胺能神經(jīng)元選擇性、進(jìn)行性的變性、缺失，導(dǎo)致黑質(zhì)－紋狀體多巴胺神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)，而引起的神經(jīng)退行性疾?。?］。PD典型臨床癥狀包括肌肉僵直、靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩以及姿勢(shì)反射障礙等。PD的致病因素仍不十分清楚，目前研究認(rèn)為與年齡老化、遺傳易感性和環(huán)境毒素等導(dǎo)致的神經(jīng)元死亡等因素有關(guān)。然而，已有的研究表明［2］，氧化應(yīng)激在多巴胺細(xì)胞死亡中起關(guān)鍵作用，是PD的發(fā)病機(jī)制之一。

酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)是多巴胺生物合成中的限速酶。在PD腦組織中，TH表達(dá)含量明顯下降，表明多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)目減少，因而TH已成為PD實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⒊晒Φ闹笜?biāo)之一。

膽綠素還原酶 B(biliverdin-Ⅸβ reductase，BVRB)，也稱黃素還原酶，存在于細(xì)胞質(zhì)，在胎兒肝臟及成人紅細(xì)胞中高表達(dá)，且在心臟、腎臟、大腦、肺臟及腎上腺均有分布［3－4］，是體內(nèi)氧化還原循環(huán)的重要成員之一。膽綠素還原酶是催化膽綠素還原成膽紅素的關(guān)鍵酶，而膽紅素具有明顯的抗氧化的生理功能。本實(shí)驗(yàn)室前期在MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠模型蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組小鼠相比，模型組小鼠黑質(zhì)紋狀體中BVRB的含量明顯增高，約為2.30倍［5］。本實(shí)驗(yàn)旨在用 MPTP和6-OHDA分別制備PD小鼠和大鼠模型，探討B(tài)VRB在黑質(zhì)紋狀體內(nèi)的表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物C57BL/6小鼠，♂，體質(zhì)量20～25 g;SD大鼠，♂，體質(zhì)量200～300 g，均由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SYXK(京)2006-0008。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，室溫和濕度分別維持在(22±2)℃和(55±5)%，明暗周期12 h，自由進(jìn)食，飲水不限。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)環(huán)境1周。

1.2試劑MPTP和 6-OHDA(美國 Sigma-Aldrich公司);TH抗體(美國Millipore公司);β-actin抗體和BVRB抗體(美國Santa Cruz公司);HRP標(biāo)記的二抗(中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.3動(dòng)物PD模型的建立

1.3.1MPTP小鼠模型小鼠適應(yīng)環(huán)境1周后，隨機(jī)分為2組，即對(duì)照組(n=12)和模型組(n=12)。模型組腹腔注射MPTP(30 mg·kg－1，溶解于生理鹽水)，對(duì)照組給予等體積生理鹽水，連續(xù)5 d，每天給藥1次，最后一次給藥后d 4處死小鼠，冰上取腦分離黑質(zhì)和紋狀體，于－80℃保存，用于分別測(cè)定多巴胺及其代謝產(chǎn)物的含量和進(jìn)行Western blot分析［6］。

1.3.26-OHDA大鼠模型大鼠適應(yīng)環(huán)境1周后，觀察確認(rèn)無旋轉(zhuǎn)行為后，隨機(jī)分為2組，即對(duì)照組(n=12)和模型組(n=12)。麻醉大鼠。以頭顱平位固定于大鼠腦立體定位儀上，消毒后于剪毛處沿大鼠腦頭蓋骨正中線切口，參照大鼠腦立體定位圖譜確定右側(cè)紋狀體注射點(diǎn)，坐標(biāo)如下:前囟前0.5 mm，正中線右1.5 mm，硬腦膜下4.5 mm;前囟后0.5 mm，正中線右 2.5 mm，硬腦膜下 4.5 mm［7］。用電動(dòng)顱骨鉆小心鉆開顱骨，用5 μl微量注射器每孔注射6-OHDA 溶液2.5 g·L－1(溶于2 g·L－1抗壞血酸注射用生理鹽水溶液)，注射速度為1 μl·min－1，停針 5 min后退針，退針?biāo)俣葹?1 mm·min－1，以防藥液溢出。外科手術(shù)方法縫合皮膚，并將術(shù)后大鼠置于安靜保溫處單籠飼養(yǎng)直至清醒，連續(xù)注射青霉素1周，劑量為每日100萬U·kg－1，自由進(jìn)食，飲水不限。對(duì)照組大鼠每孔用等量溶劑(2 g·L－1抗壞血酸注射用生理鹽水溶液)代替6-OHDA溶液注射，其他操作方法與模型組相同。造模4周后處死大鼠，取腦，冰上分離黑質(zhì)和紋狀體，于－80℃保存?zhèn)溆?，用于分別測(cè)定多巴胺及其代謝產(chǎn)物的含量和Western blot分析。

1.4指標(biāo)測(cè)定及方法

1.4.1小鼠滾筒實(shí)驗(yàn)于給藥結(jié)束后d 2進(jìn)行滾筒實(shí)驗(yàn)(SD-2小鼠滾筒儀)，本實(shí)驗(yàn)用來評(píng)價(jià)小鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力［6］。測(cè)試前訓(xùn)練2 d，每天2次，轉(zhuǎn)速為12 r·min－1，訓(xùn)練時(shí)間120 s。正式實(shí)驗(yàn)時(shí)轉(zhuǎn)速調(diào)為25 r·min－1，記錄每只小鼠從滾筒開始旋轉(zhuǎn)到離開滾筒的時(shí)間作為小鼠運(yùn)動(dòng)潛伏期，測(cè)試時(shí)間為120 s。每只小鼠重復(fù)測(cè)定3次取平均值。

1.4.2大鼠阿樸嗎啡誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)行為手術(shù)4周后，皮下注射阿樸嗎啡(0.5 mg·kg－1)誘發(fā)其旋轉(zhuǎn)行為。注射阿樸嗎啡15 min后，觀察大鼠的旋轉(zhuǎn)情況。記錄各大鼠在開始旋轉(zhuǎn)后30 min內(nèi)的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)。PD模型造模成功標(biāo)準(zhǔn)為恒定左旋，平均速度≥7 r·min－1。

1.4.3高效液相 －電化學(xué)(HPLC-EC)分析取凍存紋狀體，1 ∶10 加入 100 μl溶液 A(0.4 mol·L－1HClO4)冰浴超聲勻漿，4℃靜置1 h，離心15 min(15 000×g，4℃)，取上清加入 40 μl溶液 B(20 mmol·L－1檸檬酸鈉，300 mmol·L－1K2HPO4和 2 mmol·L－1Na2EDTA)，充分混勻后 4℃靜置 1 h，再離心15 min(15 000×g，4℃)，得到樣品上清，經(jīng)0.2 μm濾器過濾后，分析多巴胺及其代謝產(chǎn)物3，4-二羥基苯乙酸 (3，4-dihydroxyphenylacetic acid，DOPAC)和高香草酸(homovanillic acid，HVA)的含量。C18柱流速 1.0 ml·min－1，溫度(24 ± 1)℃，進(jìn)樣量 10 μl，多巴胺含量用 μg·g－1濕組織重表示［6］。

1.4.4Western blot實(shí)驗(yàn)取凍存黑質(zhì)紋狀體，1∶7 加入勻漿緩沖液〔80 mmol·L－1Tris-HCl(1 mol·L－1，pH 7.4〕，150 mmol·L－1NaCl，2 mmol·L－1Na2EDTA，1 g·L－1SDS，0.4 mmol·L－1DTT 以及蛋白酶抑制劑)，制備勻漿，冰浴30 min后，離心30 min(15 000×g，4℃)，取上清液，用BCA試劑盒蛋白定量，100℃變性5 min，經(jīng)SDS-PAGE分離后，恒流230 mA轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，50 g·L－1脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入TH抗體(稀釋比例1∶3 000)4℃孵育過夜，次日加入HRP標(biāo)記的二抗，37℃孵育2 h，ECL發(fā)光液發(fā)光，X 線片顯影、定影［8］。為確保蛋白上樣量一致，我們還對(duì)內(nèi)參蛋白β-actin進(jìn)行了Western blot分析(稀釋比例1∶1 000)。黑質(zhì)紋狀體BVRB表達(dá)的檢測(cè)與上述操作方法相同，僅所使用抗體不同(稀釋比例1∶200)。

1.4.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均以±s表示，對(duì)于MPTP小鼠數(shù)據(jù)，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較;對(duì)于6-OHDA大鼠數(shù)據(jù)，采用One-way ANOVA進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1小鼠滾筒實(shí)驗(yàn)滾筒實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見Fig 1。與正常對(duì)照組(57.83±23.83)s相比，MPTP模型組小鼠在滾筒上的停留時(shí)間(17.40±4.265)s下降(P＜0.05)，表明其運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力降低。

Fig 1 MPTP treatment reduced the latent period(time on the rotarod)of mice in the rotarod test(±s)

2.2阿樸嗎啡誘導(dǎo)的大鼠旋轉(zhuǎn)行為皮下注射阿撲嗎啡后，大鼠應(yīng)出現(xiàn)恒定左轉(zhuǎn)，即旋轉(zhuǎn)時(shí)以左側(cè)后肢為支撐點(diǎn)，頭尾相接呈環(huán)狀。發(fā)生旋轉(zhuǎn)的模型組大鼠平均旋轉(zhuǎn)圈數(shù)為(7.25±0.77)r·min－1。取發(fā)生旋轉(zhuǎn)速度≥7 r·min－1的大鼠作為6-OHDA帕金森大鼠模型，進(jìn)行后續(xù)的TH和BVRB免疫印跡分析。

2.3PD模型紋狀體內(nèi)多巴胺及其代謝產(chǎn)物含量的變化HPLC定量分析結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，MPTP模型組小鼠紋狀體內(nèi)多巴胺水平下降了93.99%。另外，DOPAC和 HVA含量分別下降88.40%和51.19%(均為P＜0.01，Tab 1)。與對(duì)照組相比，6-OHDA大鼠損毀側(cè)紋狀體中DA水平降低了99.53%;與非損毀側(cè)相比，降低了99.32%。此外，與對(duì)照組和非損毀側(cè)相比，損毀側(cè)的DOPAC和HVA含量分別下降了97.89%和89.52%，以及98.09%和90.91%。與對(duì)照組相比，非損毀側(cè)的多巴胺含量減少了30.02%(均為P＜0.01，Tab 2)。

Tab 1 MPTP effects on dopamine and its metabolites，DOPAC and HVA，in mouse striatum

Tab 2 6-OHDA effects on dopamine and its metabolites，DOPAC and HVA，in rat striatum

2.4PD模型中TH的表達(dá)變化與對(duì)照組相比，MPTP模型組小鼠黑質(zhì)紋狀體內(nèi)TH水平降低了59.69%(P＜0.05，F(xiàn)ig 1)。類似地，與對(duì)照組相比，6-OHDA模型組大鼠損毀側(cè)黑質(zhì)紋狀體內(nèi)TH表達(dá)水平減少了73.92%(P＜0.05，F(xiàn)ig 2)。此外，與非損毀側(cè)相比，損毀側(cè)TH表達(dá)水平下降了77.75%(P＜0.05，F(xiàn)ig 2)。

2.5BVRB含量在PD模型黑質(zhì)－紋狀體系統(tǒng)中的表達(dá)與對(duì)照組相比，MPTP模型組小鼠黑質(zhì)紋狀體內(nèi) BVRB水平升高了71.70%(P＜0.05，F(xiàn)ig 3)。6-OHDA模型組大鼠損毀側(cè)黑質(zhì)紋狀體BVRB含量為對(duì)照組的約2.30倍(P＜0.05，F(xiàn)ig 4)，而損毀側(cè)的BVRB水平為非損毀側(cè)的約2倍(P＜0.05，F(xiàn)ig 4)。

Fig 2 Western blot analysis of TH in nigrostriatal tissue from control and MPTP treated mice(±s，n=3)

Fig 3 Western blot analysis of TH in nigrostriatal tissue from control and unilateral 6-OHDA lesioned rats(±s，n=3)

Fig 4 Western blot analysis of nigrostriatal BVRB in control and MPTP-treated mice(±s，n=3)

Fig 5 Western blot analysis of nigrostriatal BVRB in control and unilateral 6-OHDA-lesioned rats(±s，n=3)

3 討論

PD是第二大神經(jīng)退行性疾病，其主要病理改變?yōu)楹谫|(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的變性和壞死，導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的不足，最終造成PD特有的運(yùn)動(dòng)功能障礙。PD的發(fā)病機(jī)制至今沒有完全闡明，被認(rèn)可的觀點(diǎn)有線粒體功能障礙以及氧化應(yīng)激［9］。

MPTP及其代謝產(chǎn)物MPP+都是線粒體復(fù)合物I抑制劑，MPTP在腦內(nèi)經(jīng)單胺氧化酶 B轉(zhuǎn)變?yōu)镸PP+，由多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體選擇性地?cái)z入黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)，抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ活性，使得ATP生成減少，促進(jìn)自由基生成和氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致多巴胺能能神經(jīng)元變性死亡［10］。6-OHDA通過和多巴胺競(jìng)爭，可與高親和力的多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體結(jié)合進(jìn)入黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元，并迅速被氧化形成H2O2、超氧化物等活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)，生成的大量ROS超出了多巴胺能神經(jīng)元自身抗氧化清除的能力，從而發(fā)揮細(xì)胞毒性作用［11］。因此，用 MPTP和6-OHDA制備的 PD模型中均存在氧化應(yīng)激機(jī)制。

BVRB是一個(gè)分子量為21 ku的蛋白單體，其作用底物有膽綠素-Ⅸβ，-Ⅸγ和-Ⅸδ，但不包括膽綠素-Ⅸα。BVR是氧化還原循環(huán)的重要組成部分。在生理狀態(tài)下，血紅素在血紅素加氧酶(heme oxygenase，HO)的催化下，形成膽綠素、一氧化碳和游離鐵。膽綠素進(jìn)一步由膽綠素還原酶還原成膽紅素，后者的抗氧化能力比前者強(qiáng)。據(jù)研究報(bào)道，膽紅素能保護(hù)細(xì)胞免受耐受值1萬倍以上的H2O2的損傷［12］。此外，BVR還介導(dǎo) HO-1的細(xì)胞保護(hù)作用［13］。BVRB的主要作用則是在胎兒發(fā)育早期催化血紅素的分解代謝，即它催化膽綠素-Ⅸβ還原成膽紅素-Ⅸβ。BVRB生物功能的研究仍處于起步階段。目前，還未見BVRB在PD模型中的表達(dá)變化的相關(guān)報(bào)道。

本研究主要發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了兩種PD模型黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)BVRB的表達(dá)變化。MPTP帕金森小鼠模型結(jié)果與以往報(bào)道的結(jié)果一致［5］，與正常組相比，模型組BVRB表達(dá)明顯升高。進(jìn)一步，我們?cè)?-OHDA帕金森大鼠模型中通過Western blot的方法研究了BVRB的表達(dá)。結(jié)果顯示，6-OHDA帕金森大鼠損毀側(cè)黑質(zhì)紋狀體BVRB的表達(dá)較非損毀側(cè)和對(duì)照組均明顯增高。BVRB表達(dá)水平的升高可能是機(jī)體對(duì)抗腦內(nèi)氧化應(yīng)激的一種補(bǔ)償機(jī)制。BVRB可能成為探索PD和氧化應(yīng)激的新的突破口，有可能成為潛在治療靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)BVRB和PD有關(guān)聯(lián)性，然而，為了確證BVRB在PD及氧化應(yīng)激中的作用，需要進(jìn)一步開展詳盡的機(jī)制研究。

［1］Fahn S，Sulzer D.Neurodegeneration and neuroprotection in Parkinson disease［J］.Neuro Rx，2004，1(1):139 － 54.

［2］袁惠莉，汪 璇，張麗娟，等.中藥在防治帕金森病中的作用及研究進(jìn)展［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2010，26(7):850－4.

［2］Yuan H L，Wang X，Zhang L J，et al.Mechanism and research progress of Chinese traditional medicine in the prevention and treatment of Parkinson's disease［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(7):850－4.

［3］Komuro A，Tobe T，Hashimoto K，et al.Molecular cloning and expression of human liver biliverdin-Ⅸ beta reductase［J］.Biol Pharm Bull，1996，19(6):796 －804.

［4］Pereira P J，Macedo-Ribeiro S，Parraga A，et al.Structure of human biliverdinⅨbeta reductase，an early fetal bilirubinⅨbeta producing enzyme［J］.Nat Struct Biol，2001，8(3):215 －20.

［5］Zhao X，Li Q，Zhao L，Pu X P.Proteome analysis of substantia nigra and striatal tissue in the mouse MPTP model of Parkinson＇s disease［J］.Proteomics Clin Appl，2007，1(12):1559 －69.

［6］趙 磊，蒲小平.類葉升麻苷對(duì)MPTP所致帕金森病小鼠模型的神經(jīng)保護(hù)作用［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2007，23(1):42－6.

［6］Zhao L，Pu X P.Neuroprotective effect of acteoside against MPTP-induced mouse model of Parkinson's disease［J］.Chin Pharmacol Bull，2007，23(1):42 －6.

［7］Paxinos G，Watson C，Pennisi M，Topple A.Bregma，lambda and the interaural midpoint in stereotaxic surgery with rats of different sex，strain and weight［J］.J Neurosci Methods，1985，13(2):139－43.

［8］孫建棟，苑玉和，劉 巖，等.帕金森病模型大鼠中腦α-突觸核蛋白增加［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2010，26(1):73－7.

［8］Sun J D，Yuan Y H，Liu Y，et al.Increased protein level of α-synuclein in the midbrain of Parkinson's disease rat model［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(1):73 －7.

［9］Lin T K，Liou C W，Chen S D，et al.Mitochondrial dysfunction and biogenesis in the pathogenesis of Parkinson ＇s disease［J］.Chang Gung Med J，2009，32(6):589 －99.

［10］Bougria M，Vitorica J，Cano J，Machado A.Implication of dopamine transporter system on 1-methyl-4-phenylpyridinium and rotenone effect in striatal synaptosomes［J］.Eur J Pharmacol，1995，291(3):407－15.

［11］Aluf Y，Vaya J，Khatib S，et al.Specific oxidative stress profile associated with partial striatal dopaminergic depletion by 6-hydroxydopamine as assessed by a novel multifunctional marker molecule［J］.Free Radic Res，2010，44(6):635 －44.

［12］Baranano D E，Rao M，F(xiàn)erris C D，Snyder S H.Biliverdin reductase:a major physiologic cytoprotectant［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(25):16093－8.

［13］Pachori A S，Smith A，McDonald P，et al.Heme-oxygenase-1-induced protection against hypoxia/reoxygenation is dependent on biliverdin reductase and its interaction with PI3K/Akt pathway［J］.J Mol Cell Cardiol，2007，43(5):580 －92.

［14］Chinta S J，Andersen J K.Redox imbalance in Parkinson's disease［J］.Biochim Biophys Acta，2008，1780(11):1362 －7