鈣激活中性蛋白酶-2對(duì)肝癌細(xì)胞阿霉素耐藥性的影響

徐國強(qiáng)，唐佳艷，2，向 敏，3，王 艷，洪 陽，胡曉霞，王旭東，陳騰祥

(貴陽醫(yī)學(xué)院1.生理學(xué)教研室、2.附屬醫(yī)院消化內(nèi)科、3.附屬醫(yī)院兒科，貴州 貴陽 550004，4.貴陽市衛(wèi)生局，貴州 貴陽 550081)

耐藥性是腫瘤復(fù)發(fā)以及復(fù)發(fā)后化療失效的重要原因。腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞一樣，受到外界刺激后，也可以產(chǎn)生應(yīng)激性反應(yīng)，提高其對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)性，這是腫瘤細(xì)胞對(duì)化療產(chǎn)生耐藥性的基本原理［1］。Calpain是一種蛋白質(zhì)水解酶，其通過有限酶解底物參與許多細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活動(dòng)，發(fā)揮多種生物學(xué)功能。研究發(fā)現(xiàn)［2］，calpain通過酶解細(xì)胞周期蛋白E(cyclin E)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖，提示其是促進(jìn)腫瘤惡性的重要蛋白，也可能是腫瘤細(xì)胞化療耐藥性的機(jī)制之一。研究以鈣激活中性蛋白酶-2(calpain-2)作為對(duì)象，觀察其在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)，及其與阿霉素(adriamycin，ADM)耐藥之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1藥物和試劑Calpain 2 Large Subunit(M-type)Antibody、Cyclin E(HE12)Mouse mAb(美國Cell Signaling Technology公司);calpastatin peptide(美國Merck公司)，DMEM、胎牛血清(FBS)(美國Invitrogen公司);四甲基偶氮唑鹽(MTT)、聚丙烯酰胺、雙甲叉丙烯酰胺(美國Sigma-Aldrich公司);其它試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2主要儀器及設(shè)備電泳儀及微型垂直電泳槽(美國GE公司)，GBOX iChemiXR化學(xué)發(fā)光及凝膠成像儀(美國Syngene公司)、epoch微孔板閱讀器(美國Biotek公司)，高速冷凍離心機(jī)(美國Beckman公司)。

1.3細(xì)胞株HepG2細(xì)胞株為廣州啟動(dòng)子生物科技有限公司凍存，復(fù)蘇后培養(yǎng)于 DMEM培養(yǎng)液、37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.1的FBS和0.05的CO2。

1.4MTT實(shí)驗(yàn)收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞，以每孔5 000個(gè)細(xì)胞的密度鋪于96孔板中，培養(yǎng)12 h后加入倍比稀釋的ADM(每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔)。上述條件培養(yǎng)72 h(48 h時(shí)換液和補(bǔ)充ADM 1次)。棄培養(yǎng)液，每孔加入 20 μl MTT 溶液(12.1 μmol·L－1)孵育4 h后，加入150 μl二甲基亞砜，微孔板閱讀器測(cè)各孔的吸光值(OD 490 nm)，計(jì)算半數(shù)致死量。

按上述方法將HepG2細(xì)胞鋪至96孔板中，給予ADM(LD50)或calpain-2抑制劑calpastatin peptide(20 nmol·L－1)孵育細(xì)胞72 h，如上所述用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的成活率。未予ADM和calpastatin peptide處理的HepG2的MTT值作為分母，計(jì)算其它組細(xì)胞的相對(duì)存活率。

1.5Western blotHepG2鋪6 cm培養(yǎng)皿，擴(kuò)大培養(yǎng)至80%的細(xì)胞滿度，給予ADM(LD50)或20 nmol·L－1calpastatin peptide孵育72 h。洗滌后加入預(yù)冷RIPA細(xì)胞裂解液［3］，冰上裂解10 min，刮取裂解物，4℃ 12 000 r·min－1離心 30 min，取上清液作為蛋白樣品進(jìn)行Bradford法定量，上樣行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，室溫封閉1 h，4℃ I抗孵育過夜，室溫Ⅱ抗(HRP耦合)孵育1 h，加入化學(xué)發(fā)光試劑，GBOX iChemiXR進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。Gene-Tools軟件進(jìn)行條帶分析，用calpain-2或cyclin E條帶的灰度值除以內(nèi)參 β-actin的灰度值，再乘以100%算得calpain-2或cyclin E的相對(duì)表達(dá)水平。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法利用SPSS16.0的回歸概率模型計(jì)算ADM對(duì)細(xì)胞的半數(shù)致死量，對(duì)細(xì)胞存活率和蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果

2.1ADM對(duì)細(xì)胞的抑制作用及半數(shù)致死量ADM對(duì) HepG2細(xì)胞具有明顯的抑制作用，隨著ADM濃度的增大，存活的HepG2細(xì)胞數(shù)量明顯減少，統(tǒng)計(jì)計(jì)算ADM對(duì)HepG2的半數(shù)致死量為2.5 μmol·L－1。

2.2ADM對(duì)HepG2細(xì)胞calpain-2表達(dá)及酶解的影響以ADM(2.5 μmol·L－1)處理96孔板中的HepG2細(xì)胞不同的時(shí)間，結(jié)果提示，ADM能夠誘導(dǎo)calpain-2表達(dá)，但是在短時(shí)間(4 h以內(nèi))calpain-2的表達(dá)沒有明顯增加，反而略有下降(P＜0.05)，12 h后calpain-2的表達(dá)量開始上升(P＜0.05)，48 h后尤其明顯(P＜0.01)。伴隨著calpain-2的表達(dá)量增加，其剪切片段數(shù)目也明顯增多，而且被剪切的量也增多(P＜0.05)。見Fig 1。

2.3calpain-2活性抑制對(duì)ADM作用下的HepG2的存活率的影響及Cyclin E的表達(dá)沒有ADM作用時(shí)，calpain抑制劑calpastatin peptide在72 h內(nèi)對(duì)HepG2 生長(zhǎng)沒有影響;但是給予 2.5 μmol·L－1ADM處理72 h后，HepG2的存活率下降了(P＜0.05)，而且calpastatin peptide明顯使ADM處理的HepG2細(xì)胞的存活率更低(P＜0.01)，見Fig 2。

2.4calpain-2活性抑制對(duì)ADM作用下的HepG2中的Cyclin E表達(dá)及酶解的影響Cyclin E在HepG2中有表達(dá)。沒有 ADM作用時(shí)，calpastatin peptide對(duì)cyclin E的表達(dá)沒有明顯的影響，但可以抑制cyclin E的酶解。給予2.5 μmol·L－1ADM 72 h后，cyclin E的酶解成為L(zhǎng)MW形式更加明顯(P＜0.01)，calpastatin peptide可以明顯減少ADM引起的cyclin E的酶解(P＜0.01)。見Fig 3。

Fig 1 The expression and zymohydrolysis of calpain-2 in HepG2 treated with ADM

Fig 2 The effect of calpain-2 inhibitor on the survival rate of HepG2 treated with ADM

Fig 3 The effect of calpain-2 inhibitor on the expression and zymohydrolysis of cyclin E in HepG2 treated with ADM

3 討論

ADM可干擾轉(zhuǎn)錄過程，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［4］。然而，癌細(xì)胞受到ADM刺激后，會(huì)引起應(yīng)激性的保護(hù):一方面，通過 P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)耐藥基因表達(dá)上調(diào)，減少化療藥物入胞［5］，另一方面，通過細(xì)胞周期調(diào)節(jié)機(jī)制減少細(xì)胞凋亡［6］。如結(jié)果所示，ADM刺激的早期可檢測(cè)到calpain-2的表達(dá)降低，提示在ADM早期應(yīng)激事件中，calpain-2可能被大量利用并降解減少，而作用一定時(shí)間后(大于12 h)，calpain-2的表達(dá)增高、酶解程度增強(qiáng)，表明ADM并非直接誘導(dǎo)calpain-2的表達(dá)上調(diào)和活性增加，而是通過誘導(dǎo)其它基因表達(dá)改變后，間接上調(diào)calpain-2及其活性，這與Su等［7］報(bào)道的應(yīng)激誘導(dǎo)calpain-2上調(diào)和活性有一致性。外源性給予calpain-2抑制劑后，ADM誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的程度增強(qiáng)，表明calpain-2表達(dá)和活性增加可使肝癌細(xì)胞耐受ADM誘導(dǎo)的凋亡。提示calpain-2可以作為降低腫瘤化療耐藥性的潛在靶點(diǎn)，應(yīng)予深入研究。

研究發(fā)現(xiàn)［8－9］，Calpain-2 可通過酶解 cyclin E參與細(xì)胞周期調(diào)控，并增加癌細(xì)胞的惡性程度［2］。結(jié)果提示，ADM可使肝癌細(xì)胞中cyclin E被酶解程度增加，而calpain-2抑制劑可逆轉(zhuǎn)ADM引起的cyclin E的酶解，因此表明抑制劑可通過抑制calpain-2活性而減少ADM誘導(dǎo)的cyclin E的酶解。而cyclin E酶解減少可能與肝癌細(xì)胞凋亡增加有關(guān)，這與Ugland H等的報(bào)道一致［10］。至于cyclin E的穩(wěn)定性增加如何導(dǎo)致癌細(xì)胞凋亡增加，還有待進(jìn)一步研究。

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