全反式維甲酸對(duì)骨肉瘤細(xì)胞143B生長(zhǎng)的影響

牟鈺欽，周龍洋，楊秋珺，周岐新，何百成

(重慶醫(yī)科大學(xué)藥理教研室，重慶 400016)

骨肉瘤是兒童和成人中常見的一種非血液系統(tǒng)性惡性腫瘤，多由分化程度較低的成骨細(xì)胞所致，且具有很高的肺轉(zhuǎn)移特性［1］。越來越多的證據(jù)表明，成骨分化缺陷可導(dǎo)致骨肉瘤的發(fā)生［2］，成骨祖細(xì)胞成骨分化早期出現(xiàn)調(diào)控異常，可致惡性程度很高的骨肉瘤，反之骨肉瘤的惡性程度會(huì)有所降低。骨肉瘤的臨床治療面臨多種挑戰(zhàn)，如:常規(guī)化療的副作用、腫瘤細(xì)胞的耐藥性及骨肉瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移［2］。為克服或防止這些情況的發(fā)生，采用分化治療或分化治療合并傳統(tǒng)的化療來治療這類疾病的方法越來越受到人們的重視。研究表明一些核受體激動(dòng)劑能明顯促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化而抑制腫瘤生長(zhǎng)，其中全反式維甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)已成功用于治療急性早幼粒細(xì)胞白血?。?］。文獻(xiàn)報(bào)道，ATRA能抑制骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，但其作用機(jī)制還不是很清楚;本研究對(duì)ATRA抑制骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制作進(jìn)一步探討。結(jié)果顯示，ATRA抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖作用至少與促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞成骨分化有關(guān)。

1 材料及方法

1.1試劑及細(xì)胞培養(yǎng)人骨肉瘤細(xì)胞143B和MG63購(gòu)自 ATCC(American Type Culture Collection)。全反式維甲酸購(gòu)自BIOMOL，用DMSO溶解。實(shí)驗(yàn)所用抗體均購(gòu)自 Santa Cruz。細(xì)胞培養(yǎng)用DMEM培養(yǎng)基含10%胎牛血清和1%的青、鏈霉素，培養(yǎng)條件為5%的CO2及37℃。

1.2RT-PCR及Western blot檢測(cè)將細(xì)胞鋪于T25培養(yǎng)瓶中，提取總RNA前24 h將完全培養(yǎng)基換為含1%胎牛血清的完全培養(yǎng)基。利用TRIzol法提取總RNA。通過RT-PCR制備cDNA，進(jìn)行PCR檢測(cè)維甲酸受體在骨肉瘤細(xì)胞143B和MG63中的內(nèi)源性表達(dá)。

實(shí)驗(yàn)所用PCR引物如下，RARα引物:上游5'-CAGCGACTCCTTGGACAGA-3'，下 游 5'-GGCAGAGG GGTGTCTTGAT-3';RARβ引物:上游 5'-GGTTTC ACTGGCTTGACCAT-3'，下游 5'-AAGGCCGTCTGAG AAAGTCA-3';RARγ引物:上游5'-AACAAGGTGAC CAGGAATCG-3'，下 游 5'-TGTCAGGTGACCCTTCTTC C-3';RXRα引物:上游5'-GCTTCCTTCACCAAGCA CA-3'，下游5'-CGCTTGTCAATCAGGCAGT-3';RXRβ引物:上游5'-CAGGGCAGAACCAAGAACAT-3'，下游5'-GAAATCACCCCAAATCATGG-3';RXRγ引物:上游5'-TGTGGTCAACAGTGTCAGCA-3'，下游5'-GTC TCCACAGATGGCACAGA-3'。

另將指數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞鋪于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行相應(yīng)的處理。于不同檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，提取各組總蛋白并用BCA法測(cè)定總蛋白濃度。按常規(guī)Western blot方法進(jìn)行，最后用ECL化學(xué)發(fā)光顯色，并用凝膠成像儀成像。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)將指數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞鋪于24孔板，用不同濃度的ATRA處理細(xì)胞。分別在24、48和72 h將細(xì)胞用胰酶消化進(jìn)行計(jì)數(shù)(用臺(tái)盼藍(lán)染色區(qū)別壞死細(xì)胞)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.4凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)將指數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞鋪于6孔板，用 20 μmol·L－1的 ATRA 處理 143B 細(xì)胞，分別于第12和24 h提取總蛋白，然后按前述方法進(jìn)行Western blot檢測(cè)Caspase-3的蛋白水平變化情況。另用 20 μmol·L－1ATRA 處理 143B 細(xì)胞，24 h 后進(jìn)行凋亡染色，按試劑盒說明書進(jìn)行操作(Vybrant Apoptosis Assay kit，V-23201)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)將指數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)的細(xì)胞鋪于24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，每孔利用lipofectamine(購(gòu)自 Invitrogen)轉(zhuǎn)染0.25 μg報(bào)告質(zhì)粒，6 h后終止轉(zhuǎn)染并換用正常培養(yǎng)基。加入不同濃度的ATRA，24 h后裂解細(xì)胞，按照試劑盒說明進(jìn)行螢光素酶活性測(cè)定。BCA法測(cè)定裂解液總蛋白濃度，用于對(duì)螢光素酶活性進(jìn)行校正。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.6骨橋素、骨鈣素蛋白表達(dá)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)將指數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞鋪于6孔板，待細(xì)胞貼壁后用相應(yīng)濃度的ATRA處理，分別于D9和D11提取總蛋白，通過Western blot檢測(cè)骨橋素(osteopontin，OPN)和骨鈣素(osteocalcin，OCN)蛋白表達(dá)水平。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，t-test進(jìn)行組間比較。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1維甲酸受體與視黃醇X受體在143B骨肉瘤細(xì)胞中的內(nèi)源性表達(dá)143B和MG63骨肉瘤細(xì)胞中維甲酸受體(RAR)及視黃醇X受體(RXR)的內(nèi)源性表達(dá)如Fig 1所示。RT-PCR結(jié)果顯示:RAR及RXR各型受體的mRNA在143B和MG63骨肉瘤細(xì)胞中均有表達(dá)，并且 Western blot也能夠檢測(cè)到RARα和RXRα的蛋白表達(dá)。提示，143B和MG63骨肉瘤細(xì)胞中存在維甲酸信號(hào)通路。

2.2ATRA呈現(xiàn)濃度依賴性抑制143B骨肉瘤細(xì)胞增殖ATRA對(duì)143B細(xì)胞的增殖抑制如Fig 2所示。結(jié)果顯示，ATRA能明顯抑制143B細(xì)胞增殖，并且這種抑制作用呈濃度依賴性增強(qiáng)。

2.3ATRA誘導(dǎo)143B骨肉瘤細(xì)胞凋亡ATRA誘導(dǎo)143B細(xì)胞凋亡結(jié)果如Fig 3所示。Western blot檢測(cè)Caspase-3蛋白水平結(jié)果顯示，ATRA處理143B細(xì)胞12 h后，處理組Caspase-3蛋白水平明顯高于對(duì)照組，而24 h無(wú)變化。凋亡染色結(jié)果顯示，ATRA處理后，凋亡及死亡細(xì)胞陽(yáng)性染色明顯增多。提示，ATRA能夠誘導(dǎo)143B骨肉瘤細(xì)胞凋亡。

Fig 1 Endogenous nuclear receptor expression in osteosarcoma

Fig 2 Inhibitory effect of ATRA on 143B osteosarcoma cells(±s，n=3)

Fig 3 Effect of ATRA on apoptosis of 143B osteosarcoma cells

2.4ATRA誘導(dǎo)143B骨肉瘤細(xì)胞骨向分化ATRA誘導(dǎo)143B細(xì)胞成骨分化檢測(cè)結(jié)果如Fig 4、5所示。結(jié)果顯示，ATRA處理后，Runx2報(bào)告質(zhì)粒螢光素酶活性明顯升高，表明Runx2轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)(Fig 4);Western blot結(jié)果示，OPN及OCN表達(dá)增加(Fig 5)。提示，ATRA能夠促進(jìn)143B骨肉瘤細(xì)胞骨向分化。

Fig 4 ATRA promote Runx2 induced transcription activity in 143B osteosarcoma cells(±s，n=3)

Fig 5 ATRA induced OPN and OCN expression in 143B osteosarcoma cells(n=3)

3 討論

骨肉瘤是一種惡性腫瘤，其特征是成骨祖細(xì)胞處于不同的分化狀態(tài)［4］。目前臨床對(duì)于骨肉瘤的治療面臨兩個(gè)主要的問題:其一是常規(guī)化療給患者帶來的嚴(yán)重不良反應(yīng)和毒副作用。第二個(gè)問題是難于對(duì)骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移作早期診斷。因此，臨床上急需一種低毒高效的方法治療骨肉瘤這類疾病。

誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞終末分化可以使一些惡性腫瘤得到治療，比如:用全反式維甲酸治療急性早幼粒細(xì)胞白 血 病 (acute promyelocytic leukemia，APL)［3］，PPARγ激動(dòng)劑能抑制人乳腺癌、結(jié)腸癌和脂肪肉瘤等腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)［5］。目前對(duì)腫瘤的化療主要是用細(xì)胞毒性藥物殺死增殖迅速的腫瘤細(xì)胞，這類藥物多具有嚴(yán)重的不良反應(yīng)。與傳統(tǒng)化療藥物相反，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化的藥物不僅具有較少的不良反應(yīng)，而且能明顯降低腫瘤的惡性程度。

成骨祖細(xì)胞因?yàn)橐恍┻z傳因素或突變使成骨分化過程受到干擾，最終導(dǎo)致骨肉瘤發(fā)生。這種分化缺陷的觀點(diǎn)可從以下事實(shí)得到證實(shí):骨肉瘤細(xì)胞具有末分化成骨細(xì)胞的特點(diǎn)［1，2，6］，成骨分化轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Runx2并不能有效促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞成骨分化;成骨性骨形態(tài)蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)不能誘導(dǎo)人骨肉瘤細(xì)胞成骨分化，而是表現(xiàn)出促進(jìn)骨肉瘤生長(zhǎng)［7］;我們的實(shí)驗(yàn)也顯示:多種骨肉瘤細(xì)胞株和原代骨肉瘤細(xì)胞其堿性磷酸酶表達(dá)程度存在明顯差別(資料未附)。

ATRA能與核受體RAR(Retinoic Acid Receptor)和RXR(Retinoids X Receptor)受體結(jié)合形成雜合二聚體，最終與DNA靶基因的調(diào)節(jié)位點(diǎn)結(jié)合，調(diào)節(jié)下游目的基因表達(dá)［8］。ATRA已被用于臨床治療APL，并取得了巨大的成功，其機(jī)制就是ATRA促進(jìn)急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞進(jìn)行正常分化。文獻(xiàn)報(bào)道［9］，ATRA能夠抑制骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，其機(jī)制可能涉及CyclinD2和CDK4表達(dá)的下調(diào)從而導(dǎo)致低磷酸化pRb積累;ATRA不但能夠抑制MG-63細(xì)胞生長(zhǎng)，也能抑制 MG-63細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力［10］;ATRA還可以促進(jìn)人骨肉瘤細(xì)胞一定程度良性分化［11］。ATRA能夠明顯增強(qiáng)BMP9(bone morphogenetic protein 9)誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化［12］，BMP9是目前已知BMPs成員中誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力最強(qiáng)的因子。以上研究表明，ATRA對(duì)可能是通過促進(jìn)分化抑制骨肉瘤生長(zhǎng)，但其具體機(jī)制還不清楚。

我們的研究表明，ATRA能夠使143B骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制并促進(jìn)凋亡，這種作用與ATRA促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞分化有關(guān)。ATRA能促進(jìn)成骨分化不同時(shí)期的成骨標(biāo)志物在143B骨肉瘤細(xì)胞中表達(dá):早期可以促進(jìn)成骨分化轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Runx2表達(dá)，中晚期可促使OPN及OCN表達(dá)，且晚期可促進(jìn)鈣鹽沉積(資料未附)。提示:ATRA能在不同分化階段促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞骨向分化，從而抑制骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。雖然ATRA單獨(dú)使用或許并不能有效的治療骨肉瘤，但可以作用一種輔助治療方式，與常規(guī)治療方式聯(lián)合運(yùn)用，提高對(duì)骨肉瘤的治療效果，同時(shí)降低常規(guī)治療方式帶來的嚴(yán)重不良反應(yīng)。

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