2，3-吲哚醌對多巴胺能細胞氧化損傷的保護作用

張 芳，董 海，岳 旺

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院1.藥學(xué)系、2.附屬醫(yī)院(東區(qū))重癥醫(yī)學(xué)科，山東青島 266021)

MES 23.5細胞是由大鼠中腦細胞與小鼠神經(jīng)母細胞瘤－膠質(zhì)瘤細胞株18TG2經(jīng)細胞融合技術(shù)形成的一種DA能細胞株，具有中腦黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的許多特性，它含有酪氨酸羥化酶，能夠合成DA(多巴胺)，但不合成其他兒茶酚胺［1］。氧是需氧生物生存的基本要素，但同時也是生成有害的活性氧(reactive oxygen species，ROS)的前體。當細胞內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)之間的平衡被打破，ROS生成能力超過清除能力或外源ROS大量涌入體內(nèi)時，氧化應(yīng)激便產(chǎn)生了。這是包括神經(jīng)退行性疾病在內(nèi)的50多種疾病的一個重要的發(fā)病機制［2］。H2O2是眾多種類ROS中最重要的一種，H2O2憑借其良好的細胞膜滲透性可以輕易的進入細胞內(nèi)部，并產(chǎn)生細胞毒性［3］。故本實驗我們選用H2O2造成MES 23.5細胞的損傷模型進行研究。

2，3-吲哚醌(2，3-indolinedione，isatin，ISA)，又名靛紅，是近年發(fā)現(xiàn)存在于人和動物體內(nèi)的一種內(nèi)源性活性因子，具有多種生物學(xué)活性。先前我們在多種動物模型證實ISA可提高腦內(nèi)DA含量［4］，減輕大鼠6-OHDA損毀模型的旋轉(zhuǎn)行為，同時具有抗動脈粥樣硬化［5］和抑制腫瘤生長［6］的作用，這些作用與提高細胞的抗氧化作用有密切關(guān)系。本文采用MTT、FCM和LSCM方法測定了ISA預(yù)處理對H2O2損傷的MES 23.5細胞△ψm和［Ca2+］i水平，以進一步深入探討ISA保護細胞的可能機制。

1 材料與方法

1.1細胞培養(yǎng)MES 23.5細胞由美國休斯敦貝勒醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科友情饋贈。用含5%胎牛血清的DEME/F12培養(yǎng)基(均購自美國 GIBCO-BRL公司)，在5%CO2、37℃飽和濕度條件下，于鋪被了多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。

1.2主要儀器設(shè)備CO2培養(yǎng)箱(Thermo Electron Corporation，美國);倒置顯微鏡(OLYMPUS，日本);低溫高速離心機(Eppendorf，德國);酶標儀(雷杜公司，深圳);流式細胞儀(BD Biosciences，美國)，激光掃描共聚焦顯微鏡(OX-81，Olympus，日本)。

1.3 MTT檢測

1.3.1不同濃度H2O2對MES 23.5細胞生長的影響取對數(shù)生長期的MES 23.5細胞，用DMEM/F12培養(yǎng)液稀釋成6×108cells·L－1的細胞懸液接種于鋪有多聚賴氨酸的96孔板，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后加入不同稀釋度的H2O2(5、10、20、40、80 和 160 μmol·L－1)，以新鮮配制的DMEM/F12培養(yǎng)液為陰性對照。

培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加入5 g·L－1的MTT 20 μl，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，棄上清后每孔加入DMSO 200 μl，自動酶標讀數(shù)儀比色(主波長494 nm，次波長630 nm)，測定其吸光度值。并計算各組MES 23.5細胞的存活率。細胞存活率/%=實驗組吸光度均值/陰性對照組吸光度均值×100%。

1.3.2不同濃度ISA對MES 23.5細胞生長的影響

按上述方法測定不同濃度 ISA(25、50、100、200、400 μmol·L－1)對 MES 23.5 細胞生長的影響，計算細胞存活率。

1.3.3不同濃度ISA對H2O2造成MES 23.5細胞損傷的保護作用相同方法測定不同濃度ISA(25、50、100、200、400 μmol·L－1)對 20 μmol·L－1H2O2造成MES 23.5細胞損傷的保護作用。計算各組細胞存活率。

1.4FCM檢測△ψm將MES 23.5細胞懸液接種于鋪有多聚賴氨酸的6孔板中，每孔2 ml。24 h后各孔分別加入 H2O220 μmol·L－1、H2O220 μmol·L－1+ISA 100 μmol·L－1和 DMEM/F12 培養(yǎng)液作陰性對照。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

測定△ψm:培養(yǎng)結(jié)束前30 min，棄上清，每孔加入5 mg·L－1的 R 123，37℃避光負載 30 min，HBS吹打制成單細胞懸液，200目尼龍網(wǎng)過濾后加入流式細胞儀的樣品室，以激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長523 nm測定，F(xiàn)CS/SSC設(shè)門，收集門內(nèi)10 000個細胞，CELLQuest Pro分析系統(tǒng)分析每組細胞R 123的熒光強度。

FCM分析各組細胞R 123的熒光強度，以熒光強度為101設(shè)門，低于101為M1區(qū)，高于101為M2區(qū)，M1區(qū)的細胞認為是△ψm降低，受損細胞所占比例，M2區(qū)的細胞為正常細胞所占比例。

1.5LSCM測定［Ca2+］iMES 23.5細胞懸液接種于放置了玻片并鋪有多聚賴氨酸的24孔板中。24 h 后各孔分別加入 H2O220 μmol·L－1、H2O220 μmol·L－1+ISA 100 μmol·L－1和 DMEM/F12 培養(yǎng)液作陰性對照。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結(jié)束前45 min，每孔加入 Fluo-3/AM 50 μl，37℃ 避光負載 45 min后將玻片放置于LSCM測定小室內(nèi)，由488 nm激發(fā)，檢測各組細胞發(fā)射波長525 nm處的熒光強度。以Fluoview 5.0圖像處理系統(tǒng)分析熒光強度。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理實驗結(jié)果以±s表示，應(yīng)用SPSS11.0軟件包進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，Student-Newman-Keuls檢驗，各組間率的比較進行χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1MTT檢測結(jié)果5，10 μmol·L－1的 H2O2作用于MES 23.5細胞后，對細胞存活率無影響，20 μmol·L－1及以上濃度的H2O2處理組，細胞的存活率降低(P＜0.01)，且至 160 μmol·L－1范圍內(nèi)，表現(xiàn)出濃度依賴關(guān)系。由此在本實驗中使用20 μmol·L－1的H2O2造成MES 23.5細胞損傷模型。

單獨使用不同濃度的 ISA(25、50、100、200、400 μmol·L－1)對細胞存活率無影響。25 及50 μmol·L－1ISA處理的MES 23.5細胞存活率與單獨H2O220 μmol·L－1處理組相比，差異無顯著性，ISA 100、200和400 μmol·L－1處理的細胞存活率均較單獨H2O220 μmol·L－1組有明顯升高(P＜0.01，P＜0.05，F(xiàn)ig 1)。

Fig 1 Protective effect of different concentration of ISA on the viability of H2O2-treated MES 23.5 cells

2.2FCM檢測△ψm結(jié)果20 μmol·L－1H2O2與MES 23.5細胞共同培養(yǎng)24 h后，M1區(qū)細胞所占比例平均為28.8% ±5.4%，表明28.8%的細胞△ψm降低，而對照組為21.3% ±3.3%，兩者之間差異明顯(P＜0.05);20 μmol·L－1H2O2+ISA 100 μmol·L－1組，M1區(qū)細胞所占比例平均為20.1% ±3.2%，比H2O2處理組明顯降低(P＜0.01)，完全恢復(fù)到正常水平(Fig 2B)。

MES 23.5 細胞經(jīng)20 μmol·L－1H2O2孵育 24 h后，平均熒光強度為30.0±3.5，較對照組明顯降低(46.7 ± 5.3，P＜ 0.01)。20 μmol·L－1H2O2+ISA 100 μmol·L－1組平均熒光強度為 43.0 ±4.7，較單獨使用H2O2組明顯增強(P＜0.01，F(xiàn)ig 2C)。

Fig 2A Protective effect of ISA 100 μmol·L －1on the △ψm of 20 μmol·L －1H2O2-treated MES 23.5 cell(original figure)

Fig 2B Effect of ISA 100 μmol·L －1on the △ψm of 20 μmol·L －1H2O2-treated MES 23.5 cells

Fig 2C Effect of ISA 100 μmol·L －1on the R 123 fluorescence intensity of H2O2-treated MES 23.5 cells

2.3LSCM檢測［Ca2+］i結(jié)果20 μmol·L－1H2O2組細胞內(nèi)熒光強度(160.3±48.9)與對照組(57.3±13.5)相比明顯增強(P＜0.01)，表明經(jīng)H2O2孵育后MES 23.5細胞的［Ca2+］i明顯升高;20 μmol·L－1H2O2+ISA 100 μmol·L－1組，熒光強度為83.0±8.2，比H2O2組明顯降低(P＜0.01，F(xiàn)ig 3B)。

3 討論

ISA為吲哚類衍生物，是在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性生物活性物質(zhì)［7］，且廣泛存在于海洋生物如龍蝦和十字花科植物如板藍根、甘藍等［8］。

本實驗發(fā)現(xiàn)單獨使用 25 μmol·L－1至 400 μmol·L－1的ISA對細胞存活率無明顯影響，而將一定濃度的ISA加入H2O2損傷的MES 23.5細胞后，使存活率增高，表明ISA能拮抗H2O2對MES 23.5細胞造成的損傷。

△ψm是由于線粒體內(nèi)膜兩側(cè)質(zhì)子的不對稱分布而形成的電位差，為維持線粒體正常功能所必需。在細胞受損傷早期，由于線粒體內(nèi)膜通透性轉(zhuǎn)換管孔 (permeability transition pore，PTP)開放，使膜通透性增加，△ψm下降。△ψm的變化可利用能選擇性被線粒體所吸收的熒光染料——R 123來測定，F(xiàn)CM檢測細胞熒光強度的變化反映△ψm變化，檢測出早期受損傷的細胞［9］。生理情況下PTP周期性開放，以維持線粒體內(nèi)電化學(xué)平衡，保持氧化還原通路的暢通。細胞凋亡過程中，PTP不可逆性開放，導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜兩側(cè)離子梯度消失，△ψm降低，呼吸鏈與氧化磷酸化失偶聯(lián)，最終引起細胞凋亡［10］。本實驗20 μmol·L－1H2O2組 MES 23.5 細胞的 R 123吸收值明顯低于對照組，且△ψm降低的細胞所占比例明顯增高，即△ψm已發(fā)生異常改變。多種原因均能誘導(dǎo)PTP的開放，其中高濃度Ca2+和ROS尤為重要［11］。

Fig 3A Effect of ISA 100 μmol·L －1on the Fluo-3 fluorescence intensity of H2O2-treated MES 23.5 cell(original figure，40 × )

Fig 3B Effect of ISA 100 μmol·L －1on the Fluo-3 fluorescence intensity in H2O2-treated MES 23.5 cells

維持細胞內(nèi)低濃度的Ca2+是細胞正常與否的一個重要標志，細胞內(nèi)Ca2+的超負荷是導(dǎo)致細胞變性壞死的重要因素［12］。大量ROS可破壞細胞膜，造成膜通透性增加從而使Ca2+內(nèi)流增加。ROS還可損傷線粒體膜，導(dǎo)致ATP生成減少，抑制鈣泵活性;ROS損傷肌漿網(wǎng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，影響Ca2+的轉(zhuǎn)運，加劇細胞內(nèi) Ca2+超載［13］。

本實驗 20 μmol·L－1H2O2孵育 MES 23.5 細胞24 h后，細胞內(nèi)Fluo-3熒光強度明顯升高，表示MES 23.5 細胞［Ca2+］i升高;100 μmol·L－1的 ISA處理后，細胞內(nèi)Fluo-3熒光強度較H2O2處理組明顯降低，表示 ISA處理降低了 MES 23.5細胞［Ca2+］i水平。

線粒體對Ca2+的攝取和釋放在胞質(zhì)鈣離子濃度的調(diào)節(jié)中起重要作用。當［Ca2+］i升高時，線粒體代償性攝入Ca2+。Ca2+的攝入常伴隨線粒體膜的去極化和H+的排出，還有線粒體內(nèi)Ca2+濃度的增加，當Ca2+攝入過量時，這些因素均促使線粒體內(nèi)膜PTP開放，其結(jié)果線粒體膜對離子通透性升高，Ca2+流入胞質(zhì)，△ψm降低和氧化磷酸化的脫偶聯(lián)［14］。

在使用了ISA后，減輕了H2O2對MES 23.5細胞造成的損傷。該保護作用主要通過ISA的抗氧化作用，降低了［Ca2+］i水平，減少PTP的開放，△ψm降低減輕。

本實驗中研究的ISA對DA能神經(jīng)元的保護作用以及對其可能機制的初步探討，為DA系統(tǒng)功能失調(diào)相關(guān)疾病的預(yù)防與治療提供新的可能方案，為這一海洋活性物質(zhì)的新用途和進一步開發(fā)提供實驗依據(jù)。

［1］Grawford G D Jr，Le W D，Smith R G，et al.A novel N18TG2 ×Mesencephalon cell hybrid expresses properties that suggest a dopaminergic cell line of substantia nigra origin［J］.J Neuro Sci，1992，12(9):3392－8.

［2］Shirlee T，Malcolm W.Oxidative stress induces a form of programmed cell death with characteristics of bothapoptosis and necrosis in neuronal cells［J］.J Neurochem，1998，71(1):95 －105.

［3］陳剛領(lǐng)，鄭建普，李亞娟，卞 卡.H2O2氧化損傷血管內(nèi)皮模型的構(gòu)建及超氧化物歧化酶對損傷的逆轉(zhuǎn)作用［J］.中國藥理學(xué)通報，2009，25(7):884－7.

［3］Chen G L，Zheng J P，Li Y J，Bian K.The construction of H2O2induced vascularendothelial damage model and reversal effect of SOD to the endothelial function［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(7):884－7.

［4］張 芳，岳 旺.2，3-吲哚醌對MPTP損傷的C57小鼠的抗氧化酶活性的作用［J］.中國藥房，2008，19(22):1696－7.

［4］Zhang F，Yue W.The antioxidation effect of isatin on MPTP-damaged C57 mice［J］.Chin Pharmacy，2008，19(22):1696 －7.

［5］劉占濤，楊志宏，趙永娟，等.2，3-吲哚醌對實驗性動脈粥樣硬化調(diào)血脂作用的研究［J］.中國藥理學(xué)通報，2006，22(10):1279－80.

［5］Liu Z T，Yang Z H，Zhao Y J，et al.The effect of 2，3-dioxoindoline on regulating hyperlipidemia of experimental atherosclerosis in quails［J］.Chin Pharmacol Bull，2006，22(10):1279 －80.

［6］王 蕾，曹 靜，鞠傳霞，等.2，3-吲哚醌抗腫瘤作用研究［J］.中國藥理學(xué)通報，2007，23(8):1052－6.

［6］Wang L，Cao J，Ju C X，et al.A study on the anti-tumor effect of 2，3-indolinedione［J］.Chin Pharmacol Bull，2007，23(8):1052－6.

［7］孫 偉，李冬梅，李 靜，等.癌癥患者尿液2，3-吲哚醌含量的測定及其臨床意義［J］.中國藥學(xué)雜志，2008，43(2):149－51.

［7］Sun W，Li D M，Li J，et al.Determination of urinary isatin in patients with cancer and its clinical significance［J］.Chin Pharma-ceutical J，2008，43(2):149 －51.

［8］劉占濤，仲偉珍，楊志宏，等.海洋活性物質(zhì)2，3-吲哚醌對實驗性高脂血癥的預(yù)防作用［J］.中國海洋藥物，2006，25(3):.37－9.

［8］Liu Z T，Zhong W Z，Yang Z H，et al.Preventive effects of 2，3-dioxoindoline on experimental hyperlipidemia［J］.Chin J Marine Drugs，2006，25(3):37 －9.

［9］Lenaz G，Baracca A，F(xiàn)ato R，et al.Mitochondrial ComplexⅠ:structure，function，and implications in neurodegeneration［J］.Ital J Biochem，2006，55(3):232－53.

［10］Zamzami N，Marchetti P，Castedo M，et al.Sequential reduction of mitochondrial transmembrane potential and generation of reactive oxygen species in early programmed cell death［J］.J Exp Med，1995，182(2):367－77.

［11］Jordan J，Cena V，Prehn J H.Mitochondrial control of neuron death and its role in neurodegenerative disorders［J］.J Physiol Biochem，2003，59(2):129－41.

［12］Brookes P S，Yoon Y，Robotham J L，et al.Calcium，ATP，and ROS:a mitochondrial love-hate triangle［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2004，287(4):817 －33.

［13］Camello-Almaraz C，Gomez-Pinilla P J，Pozo M J，et al.Mitochondrial reactive oxygen species and Ca2+signaling［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2006，291(5):1082 －8.

［14］Kann O，Kovacs R.Mitochondria and neuronal activity［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2007，292(2):641 －57.