山茱萸最佳配伍組分對(duì)高糖致ECV304細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

許惠琴，農(nóng)偉虎，劉成鼎，李 莉，劉 洪，劉 斌，吳佳蕾

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，2.江蘇省中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210046)

目前認(rèn)為，糖代謝紊亂、活性氧失衡、血管活性物質(zhì)、遺傳因素及生長(zhǎng)因子在糖尿病血管病變的發(fā)生發(fā)展中都起著重要作用，其中活性氧的作用日益受到重視［1］。已往的實(shí)驗(yàn)觀察到血管內(nèi)皮細(xì)胞在高糖環(huán)境中損傷明顯，細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞周期均發(fā)生明顯的改變［2－3］。為此，本實(shí)驗(yàn)通過觀察 ECV304細(xì)胞在高濃度葡萄糖作用下超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)及活性氧(ROS)的變化，研究山茱萸最佳配伍組分保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用機(jī)制。

1 材料

1.1藥物及試劑山茱萸藥材購(gòu)于河南西峽，經(jīng)我校中藥鑒定教研室吳德康教授鑒定為山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.etZucc.的干燥成熟果肉。

山茱萸有效部位的制備:環(huán)烯醚萜苷:藥材500 g加12倍量的水提取2次，每次2 h，濾液70%乙醇醇沉，靜置24 h以上，過濾。將上清液加水定容至0.5 g生藥/ml，上大孔樹脂用12倍量10%乙醇3.5 BV/h洗脫，洗脫液濃縮，減壓干燥至恒重，得到山茱萸環(huán)烯醚萜總苷24.9588 g(純度馬錢苷25.01%;莫諾苷15.16%;二苷總和40.17%);三萜酸:將水提后藥渣瀝干，按1∶6(溶劑:未水提之前的藥材質(zhì)量)95%乙醇在85℃，提取2次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，真空干燥得干浸膏。將干浸膏用10%NaOH洗滌，再用等倍量的酸性水溶液沉淀得三萜酸浸膏1.1692g(純度58%);多糖:將水提醇沉的藥渣在0.15 Mpa，35℃超濾，于60℃真空干燥至恒重，得到山茱萸總多糖提取物36.8694 g(純度55.93%)，然后用分子篩篩選得到1 000～60 000 ku的多糖(經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明為最具活性的多糖部分)。

經(jīng)前期正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)山茱萸防治糖尿病血管病變的最佳有效部位配比是環(huán)烯醚萜苷(A)∶三萜酸(B)∶多糖(C)為2∶1∶2(該比例折合山茱萸中所含份量表示，以下用A2B1C2表示)。

注射用鹽酸川芎嗪(川青)，哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司，批號(hào):090812。RPMI 1640培養(yǎng)基，Gibco，USA，lot NO:461418。碳酸氫鈉，上海試劑四廠，批號(hào):20000910。小牛血清(FBS)，杭州四季青生物工程材料有限公司，批號(hào):080405。胰蛋白酶(Trypsin)，MERCK，USA，批號(hào):0428S05。乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào):F20070919。磷酸鹽緩沖溶液，中杉金橋。葡萄糖，中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑有限公司，批號(hào):F20070919。超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒，批號(hào):20100119;丙二醛(MDA)試劑盒，批號(hào):20100119;谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒，批號(hào)20100119，南京建成生物工程研究所提供。

2'，7'-二氯氫化熒光素二脂(2'，7'-dichlorofluorescin-diacetate，DCFH-DA)，碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào):S0033。

1.2動(dòng)物及細(xì)胞株清潔級(jí)SD大鼠，220～240 g，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證:SCXK(蘇)2002-0027。ECV304，引自南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，由本實(shí)驗(yàn)室復(fù)蘇、傳代保存。

1.3儀器DKB-8A型電熱恒溫水槽，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。NAPCO5410型 CO2培養(yǎng)箱，PERCISION SCIENTIFIC。XSZ-D2型倒置顯微鏡，重慶光學(xué)儀器廠。LDZ5-2醫(yī)用離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠。TCS SP5型激光共聚焦顯微鏡，德國(guó)Leica公司。TU-1800S型紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

2 方法

2.1含藥血清的制備取SD大鼠，給藥劑量為116 mg·kg－1，每天灌胃給藥1次，每次給藥容積為10 ml·kg－1;另設(shè)空白對(duì)照組每天灌服等體積蒸餾水。連續(xù)給藥5 d后禁食8 h，于d 6末次給藥1 h后頸動(dòng)脈取血，4℃靜置 4 h，3 000 r·min－1離心 20 min，分離血清，于56℃水浴中滅活補(bǔ)體30 min，經(jīng)0.22 μm微孔濾器除菌，－20℃保存?zhèn)溆?。以此作為山茱萸有效部位最佳配伍組分高劑量組，稀釋一半作為其最佳配伍組分低劑量組。

2.2細(xì)胞培養(yǎng)及給藥將ECV304細(xì)胞接種至24孔(每孔1 ml)培養(yǎng)板內(nèi)，加入10%FBS RPMI 1640培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞融合80% ～90%，換液加入RPMI 1640培養(yǎng)液，24 h后吸去上清，加含30 mmol·L－1高糖的RPMI 1640培養(yǎng)液。然后各組分別加入A2B1C2含藥血清低、高劑量和川芎嗪，培養(yǎng)48 h。

2.3細(xì)胞培養(yǎng)上清液中SOD、MDA和GSH-Px的測(cè)定培養(yǎng)48 h后取細(xì)胞上清液，按試劑盒說明書測(cè)定SOD、MDA和GSH-Px。

2.4細(xì)胞內(nèi)ROS的測(cè)定吸棄培養(yǎng)上清后，將10 μmol·L－1DCFH-DA 400 μl加到細(xì)胞板中，37℃繼續(xù)培養(yǎng)20 min。吸棄上清，加無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)液400 μl，用激光共聚焦顯微技術(shù)(激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm)分別檢測(cè)各組的熒光強(qiáng)度。

2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)量資料以±s表示，數(shù)據(jù)用SPSS11.5軟件包進(jìn)行處理，組間比較方差齊性的采用LSD，方差不齊者采用秩和檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1對(duì)SOD、MDA和GSH-Px的影響采用黃嘌呤氧化酶法于550 nm處測(cè)定SOD的活力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，30 mmol·L－1高糖環(huán)境下SOD酶活性降低(P＜0.01)，而A2B1C2含藥血清兩個(gè)劑量組均能提高此活力，與高糖組比較差異具有顯著性(P＜0.01)。

根據(jù)過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的MDA可與硫代巴比妥酸(TBA)縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532 nm處有最大吸收峰的原理，采用TBA法于532nm處測(cè)定MDA的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高糖環(huán)境下，細(xì)胞上清液中MDA含量增加(P＜0.01)，而A2B1C2高、低劑量組含藥血清能降低其含量，與高糖組相比差異有顯著性(P＜0.01，P＜0.05)。

根據(jù)GSH-Px可促進(jìn)過氧化氫與GSH反應(yīng)生成GSSG的原理，通過測(cè)定酶促反應(yīng)中GSH的消耗速度來反映GSH-Px的活力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，30 mmol·L－1高糖環(huán)境下，GSH-Px活性降低(P＜0.01)，而A2B1C2高、低劑量組含藥血清能提高此活力，與高糖組比較差異具有顯著性(P＜0.01，P＜0.05)，見Tab 1。

Tab 1 Effect of the best compatibility of components in Fruetus Corni on the activity of SOD，MDA and GSH-Px in ECV304 cultured in high glucose medium(n=8)

3.2對(duì)ROS的影響根據(jù)DCFH-DA進(jìn)入細(xì)胞后的水解產(chǎn)物DCFH可以被細(xì)胞內(nèi)活性氧氧化為有熒光的DCF，通過檢測(cè)DCF的熒光強(qiáng)度來反映細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，30 mmol·L－1高糖增加ROS含量，而A2B1C2高、低劑量組含藥血清能減少ROS水平，與高糖組比較差異具有顯著性(P＜0.01，P＜0.05)，結(jié)果見 Tab 2，F(xiàn)ig 1。

4 討論

山茱萸中相關(guān)活性成分主要是五環(huán)三萜酸、總苷及多糖。既往研究發(fā)現(xiàn)［4－5］，山茱萸乙酸乙酯提取部位、乙醇提取液具有降低血糖和升高胰島素水平。山茱萸環(huán)烯醚萜苷對(duì)糖尿病血管病變大鼠，能保護(hù)胸主動(dòng)脈內(nèi)皮、減少尿微量白蛋白的排出、下調(diào)腎皮質(zhì)RAGE及TGF-β mRNA的表達(dá)，保護(hù)血管內(nèi)皮及抗腎小球內(nèi)基質(zhì)增生、基底膜增厚等作用［6－9］。山茱萸多糖具有抗氧化作用［10－11］。據(jù)此，實(shí)驗(yàn)室將山茱萸有效部位環(huán)烯醚萜苷、多糖和三萜酸加以配伍組合，試圖觀察在抗糖尿病血管病變上是否具有增強(qiáng)作用及何種比例獲得最佳效果。結(jié)果在前期實(shí)驗(yàn)中，通過高糖對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖反應(yīng)和對(duì)四氧嘧啶糖尿病小鼠的腎臟保護(hù)作用，篩選得到山茱萸最佳配伍組合為環(huán)烯醚萜苷∶三萜酸∶多糖比例是2∶1∶2。因此本實(shí)驗(yàn)試圖從抗氧化水平的角度，分析山茱萸最佳配伍組合保護(hù)糖尿病血管病變的作用機(jī)制。

Fig 1 Effect of the best compatibility of components in Fruetus Corni on the ROS levels in ECV304 cultured in high glucose medium

Tab 2 Effect of the best compatibility of components in Fruetus Corni on the ROS levels in ECV304 cultured in high glucose medium(n=6)

有研究表明在長(zhǎng)期高糖環(huán)境下，能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生多重代謝障礙，導(dǎo)致大量ROS堆積，細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激增加，造成腎臟損傷，同時(shí)ROS又可激活炎癥過程刺激信號(hào)的傳遞介質(zhì)如NF-κB途徑而損傷腎臟［12－13］。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物之一，常?？煞从持|(zhì)過氧化的程度［14］，間接反映出機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。而此時(shí)機(jī)體內(nèi)抗氧化物質(zhì)如SOD、GSH-Px等活性降低，明顯削弱了機(jī)體清除自由基的能力。本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，30 mmol·L－1濃度葡萄糖刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞后，ROS與MDA水平較正常組有明顯提高(P＜0.05，P＜0.01)，SOD、GSH-Px活性明顯降低(P＜0.01)，顯示高糖可通過氧化應(yīng)激反應(yīng)損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞。在應(yīng)用山茱萸最佳配伍組合后，對(duì)上述指標(biāo)具有明顯的逆轉(zhuǎn)作用，且高劑量組優(yōu)于低劑量組。其保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞主要通過以下2種途徑:①抑制ROS的生成，減少各種氧自由基對(duì)細(xì)胞的氧化損傷;②增強(qiáng)SOD、GSH-Px等抗氧化酶系統(tǒng)的活性，對(duì)抗氧自由基和脂質(zhì)過氧化物對(duì)細(xì)胞的毒害作用，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性?？傊緦?shí)驗(yàn)研究表明山茱萸最佳配伍組合是通過抑制高糖所致的氧化應(yīng)激，達(dá)到防治糖尿病血管病變的目的。

［1］Ceriello A，Motz E.Is oxidative stress the pathogenic mechanism underlying insulin resistance，diabetes，and cardiovascular disease?The common soil hypothesis revisited［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2004，24(5):816 －23.

［2］McGinn S，Saad S，Poronnik P，et al.High glucose-mediated effects on endothelial cell proliferation occur via p38 MAP kinase［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，2003，285(4):E708 －17.

［3］張春晶，于海濤，孫 艷，等.谷氧還蛋白1對(duì)高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡保護(hù)作用的研究［J］.醫(yī)學(xué)研究雜志，2009，38(6):38－41.

［3］Zhang C J，Yu H T，Sun Y，et al.Protective effect of glutaredoxin 1 on the high glucose-induced apoptosis in cultured vascular endothelial cells［J］.J Med Res，2009，38(6):38 － 41.

［4］陳 霞，沈愛寶，錢東升.山茱萸不同提取部位對(duì)小鼠血糖的影響［J］.南通醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，24(2):365 －6.

［4］Chen X，Shen A B，Qian D S.Experimental study of extraction at different location from Fruetus Corni in hypoglycemic effects［J］.Acta Acad Med Nantong，2004，24(2):365－6.

［5］錢東生，羅 琳，何 敏，等.山茱萸乙醇提取液對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠的治療效應(yīng)［J］.南通醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，20(4):337.

［5］Qian D S，Luo L，He M，et al.Therapeutic effect of alcohol extract of Cornus officinalis Sieb.Et Zucc on type-2 diabetic mellitus rats［J］.Acta Acad Med Nantong，2000，20(4):337.

［6］Xu H Q，Hao H P，Zhang X，et al.Morroniside protects cultured human umbilical vein endothelial cells from damage by high ambient glucose［J］.Acta Pharmacol Sin，2004，25(4):412 － 5.

［7］Xu H Q，Hao H P.Effects of iridoid total glycoside from Cornus officinalis on prevention of glomerular overexpression of transforming growth factor beta 1 and matrixes in an experimental diabetes model［J］.Biol＆Pharma Bull，2004，27(7):1014 －8.

［8］Xu H Q，Shen J，Liu H，et al.Morroniside and loganin extracted from Cornus officinalis have protective effects on rat mesangial cell proliferation exposed to advancedglycation end products by preventing oxidative stress［J］.Can J Physiol Pharmacol，2006，84(12):1627－273.

［9］許惠琴，劉 洪，沈 健，時(shí) 艷.山茱萸環(huán)烯醚萜總苷對(duì)AGEs培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞的影響［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2006，22(4):432 －6.

［9］Xu H Q，Liu H，Shen J，Shi Y.Influence of iridosides of cornus officinalis on glomerular mesangial cells cultured with AGEs［J］.Chin Pharmacol Bull，2006，22(4):432 －6.

［10］苗明三，楊 云.山茱萸多糖抗氧化作用研究［J］.河南中醫(yī)，2002，22(1):66 －7.

［10］Miao M S，Yang Y.The antioxidant effect of Cornus officinalis polysaccharide［J］.Henan Trad Chin Med，2002，22(1):66 －7.

［11］李 平，王艷輝，馬潤(rùn)宇.水提山茱萸多糖的理化性質(zhì)及抗氧化活性研究［J］.食品科學(xué)，2003，24(7):133－7.

［11］Li P，Wang Y H，Ma R Y.Study of water extract of Fruetus Corni polysaccharide on physical and chemical properties and antioxidant activity［J］.Food Sci，2003，24(7):133 －7.

［12］Lee E A，Seo J Y，Jiang Z，et al.Reactive oxygen species mediate high glucose-induced plasminogen activator inhibitor-1 up-regulation in mesangial cells and in diabetic kidney［J］.Kidney Int，2005，67(5):1762 －71.

［13］Kanwar Y S，Wada J，Sun L，et al.Diabetic nephropathy:mechanisms of renal disease progression［J］.Exp Biol Med，2008，233:4－11.

［14］Ilhan N，Halifeoglu I，Ozercan H I.Tissue malondialdehyde and adenosine triphosphatase level after experimental liver ischaemiareperfusion damage［J］.Cell Biochem Funct，2001，19:207 －12.