不同的脫鈣液在骨組織制片中的比較應(yīng)用

羅燦嶠 莫木瓊 鐘覺民

骨組織是一種堅(jiān)硬的結(jié)締組織，由骨細(xì)胞和骨基質(zhì)組成，骨基質(zhì)內(nèi)含大量無機(jī)鹽，主要是羥磷灰石-磷酸鈣和碳酸鈣。由于磷酸鈣和碳酸鈣的存在造成骨組織的硬度較大，不易切片且極易脫片，因此在病理制片過程中，必須要進(jìn)行脫鈣處理，但如果骨組織脫鈣過度又會嚴(yán)重影響組織細(xì)胞染色效果，或使組織抗原丟失，從而影響對病變組織的病理診斷或科學(xué)實(shí)驗(yàn)工作。因此，必須尋找一種合適的脫鈣液進(jìn)行骨組織脫鈣?，F(xiàn)時(shí)的脫鈣液有無機(jī)酸(硝酸、鹽酸、硫酸)和有機(jī)酸(蟻酸、醋酸、甲酸等)，也可以利用電解、微波等進(jìn)行物理脫鈣，或混和使用［1］。本研究希望通過對比各種脫鈣液的脫鈣效果及其后HE染色和免疫組化效果，探討既方便臨床應(yīng)用，又適合科學(xué)研究的脫鈣方法。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本 選取2008年1月至2008年8月我院手術(shù)室送檢的手術(shù)標(biāo)本50例，其中有長骨、短骨、不規(guī)矩骨，包含骨干和骨端的骨皮質(zhì)、骨髓質(zhì)。

1.2 材料與設(shè)備 所有化學(xué)試劑均由廣州化學(xué)試劑一廠生產(chǎn);切片機(jī)、染色機(jī)和切片刀片均由英國shandan公司生產(chǎn)。

1.3 脫鈣液的配制 14份濃硝酸加86份自來水配制成14%硝酸;10份濃鹽酸加90份自來水配制成10%鹽酸;鹽酸20 ml，甲酸20 ml，自來水 100 ml，配制成 20% 甲鹽酸;EDTA二鈉鹽10 g，PBS溶液100 ml(滴加NAOH溶液至溶解，然后用HCL中和至pH 7.0)配制成EDTA脫鈣液。

1.4 步驟 每例標(biāo)本平均分成4份，確保所有骨組織的性質(zhì)都一樣。新鮮骨組織及時(shí)用10%中性福爾馬林水溶液固定。充分固定后，用鋒利的鋼鋸將骨組織切成小塊，大小約1.5 cm×1.5 cm×0.3～0.5 cm，厚0.3 cm～0.5 cm，然后充分浸泡在不同脫鈣液中，間隔一定時(shí)間后更換脫鈣液，當(dāng)用縫衣針順利穿過無阻力感、手術(shù)刀可順利切開即為脫鈣成功。繼而進(jìn)行常規(guī)脫水、石蠟包埋、HE染色。

2 結(jié)果

2.1 脫鈣效果 14%硝酸最好。14%硝酸＞10%鹽酸＞20%甲鹽酸＞EDTA脫鈣液(見表1)。

2.2 脫鈣時(shí)間 14%硝酸時(shí)間最短。14%硝酸＞10%鹽酸＞20%甲鹽酸＞EDTA脫鈣液(見表1)。

2.3 對組織損傷 EDTA脫鈣液對骨組織的損傷最小，對組織損傷:EDTA脫鈣液＜10%鹽酸＜20%甲鹽酸＜14%硝酸(見表1)。

2.4 切片質(zhì)量 14%硝酸切片質(zhì)量最好。EDTA脫鈣液切片質(zhì)量最差，骨組織中鈣鹽殘存，出現(xiàn)“返砂”現(xiàn)象，切片在鏡下或肉眼可見非常明顯的“刀痕”現(xiàn)象，甚至影響觀察(見表1)。

表1 4種脫鈣液效果比較

2.5 脫鈣后HE染色的效果 10%鹽酸脫鈣后HE染色的效果最好，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)層次分明，對比清晰，顏色鮮艷。其余脫鈣后HE染色的效果14%硝酸＜20%甲鹽酸＜EDTA脫鈣液(見圖1)。

圖1 A.14%硝酸;B.10%鹽酸;C.20%甲鹽酸;D.EDTA脫鈣液

3 討論

脫鈣是骨組織制片中的重要一環(huán)，也是病理技術(shù)難點(diǎn)，而脫鈣劑的選擇尤其重要。

14%硝酸脫鈣液是目前臨床使用最廣的一種脫鈣液，主要是因?yàn)槠涿撯}能力最強(qiáng)，脫鈣時(shí)間最短，但這也使得骨組織的脫鈣程度較難掌握，往往造成過度脫鈣。同時(shí)，14%硝酸的滲透能力差，對骨組織特別是比較硬的骨組織滲透能力更差，導(dǎo)致其對不同組織的滲透程度不相同，脫鈣效果不一樣，部分標(biāo)本出現(xiàn)“返砂”現(xiàn)象，制片易出現(xiàn)明顯“刀痕”現(xiàn)象，影響觀察。另外，14%硝酸脫鈣液對組織的損傷最大，脫鈣后組織腫脹明顯，組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)難以保持完整清晰。由于14%硝酸為強(qiáng)酸，脫鈣后細(xì)胞核的染色能力下降，切片經(jīng)常規(guī)HE染色后細(xì)胞核著色能力下降而返藍(lán)困難而變成淡紅色，對比度差。此外，強(qiáng)酸在溶解骨組織鈣鹽的同時(shí)也容易破壞抗原物質(zhì)，使得抗原的免疫活性降低，在免疫組化染色中抗原不能有效表達(dá)，往往造成假陰性。

10%鹽酸脫鈣液處理后的骨組織軟硬適中，脫鈣充分，常規(guī)脫水包埋切片無龜裂，刀痕少，無“返砂”現(xiàn)象，切面光滑無皺縮脫落;HE染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察蘇木素、伊紅現(xiàn)象色對比清晰，染色均勻無發(fā)白，細(xì)胞核無皺縮和腫脹變形;但脫鈣時(shí)間較長，對于比較硬的組織脫鈣時(shí)間會更長，限制其臨床應(yīng)用。

20%甲鹽酸脫鈣液的酸性較溫和，脫鈣徹底干凈，對組織損傷性少，脫鈣后組織不變色仍保持組織原來的光澤。脫鈣效率顯著提高，制作出的切片用于HE染色及免疫組織化學(xué)研究，都能得到優(yōu)良效果，免疫組織化學(xué)染色能理想地顯示抗原物質(zhì)，免疫組化陽性反應(yīng)物為棕黃色，定位明確，組織切片背景干凈。

由于EDTA是一種優(yōu)良的脫鈣螯合劑，故EDTA脫鈣液的脫鈣作用優(yōu)于酸性溶液，對組織破壞極小，能保持組織細(xì)胞的完整結(jié)構(gòu)，尤其細(xì)胞顯微化學(xué)改變甚微，且能保存組織中的抗原物質(zhì)和某些酶類的活性，有利于組織免疫組化和組織化學(xué)染色，從而更進(jìn)一步地保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精確性［2］。EDTA脫鈣液脫鈣作用較緩慢，一般要4～5周，大多要5～6周，脫鈣溫度以常溫為宜，可加溫至37°C快速脫鈣，但脫鈣效果不理想［3］。另外，EDTA脫鈣液在使用過程中還需注意不宜用金屬容器，盡量用玻璃容器;同時(shí)，組織經(jīng)過脫鈣后必須在流動的自來水充分沖洗，自來水的弱堿性可中和殘留在組織中的脫鈣液酸性，有利于組織切片蘇木素的著色，同時(shí)由于脫鈣對組織細(xì)胞或多或少都有影響，蘇木素染色可以適當(dāng)延長時(shí)間以保證蘇木素著色。

［1］ 王伯云，李玉松，黃高升，等．病理學(xué)技術(shù)．北京;人民衛(wèi)生出版社，2000:943．

［2］ 劉大維，初同偉，張良，等．EDTA微波脫鈣骨的免疫組化染色．第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，25(1):77-78．

［3］ 黃美雅，黃云梅，林燕萍，鄭良樸．EDTA脫鈣方法的實(shí)驗(yàn)觀察．福建中醫(yī)藥，2007，38(4):46-47．