中性蛋白酶水解蛋清蛋白的工藝

周利亙，王君虹，張治國，陳新峰，馮鳳琴，劉相真

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學院 食品科學研究所，浙江 杭州 310021;2.浙江大學 食品科學與營養(yǎng)系，浙江 杭州 310029;3.浙江省茶葉集團 茶葉研究所有限公司，浙江 杭州 310016)

蛋清蛋白含有豐富的蛋白質和人體所必需的多種氨基酸，且氨基酸組成配比均衡性好，是機體利用率最高的一種蛋白質。其營養(yǎng)成分和分子結構與人體血漿白蛋白十分相似，從而使其具有極強的營養(yǎng)和保健作用［1］。蛋清蛋白經(jīng)過蛋白酶水解后，分子量降低，蛋白質的功能性質得到改善，溶解性提高，粘度、熱凝固性降低，蛋白質的致敏性降低，更易于消化，并能產(chǎn)生抗氧化、降血脂、降血壓等生理活性的小分子肽［2-4］。實驗選用中性蛋白酶酶解蛋清蛋白粉制備蛋清蛋白肽，研究中性蛋白酶水解制備蛋清蛋白肽的工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料

蛋清粉，粗蛋白含量83.37%，購自大連綠雪蛋品發(fā)展有限公司。中性蛋白酶，購自南寧龐博生物工程有限公司。該酶由枯草芽孢桿菌1398發(fā)酵而來，酶活為80 000 U·g-1，最適酶解條件為50～55℃，pH值7.0～7.5。

使用的儀器設備有離心機、HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋、pHS-3 C精密pH計等。

1.2 方法

配制5%蛋清粉溶液作為底物溶液，分別進行水解時間 (A)，底物 pH值 (B)，加酶量 (C)和水解溫度 (D)的單因子試驗和采用正交表L9(34)設計正交試驗。按照試驗設計調(diào)節(jié)底物溶液的pH值，在設定溫度的水浴鍋中溫育10 min，加入設定量的酶進行酶解，酶解時間為所設計時間。水解過程中水浴控溫、每30 min震蕩混勻1次，并滴加濃氫氧化鈉溶液使底物溶液的pH值維持在設定值。水解結束后，半微量凱氏定氮法測定總氮含量，計算氮回收率［5］。

氮回收率 (%)=所得上清液體積 (mL)×氮含量 (g·mL-1)/［底物體積 (mL)× 底物氮含量 (g·mL-1)］×100。

1.3 統(tǒng)計分析

單因子試驗結果用Office EXCEL軟件包作圖。正交試驗結果采用SPSS 16.0 GLM中單變量方差分析程序處理，P＜0.05視為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 水解時間

5%蛋清粉溶液，pH值6.5，溫度為50℃，加酶量為4 000 U·g-1蛋清粉，分別水解不同時間。結果表明，隨著水解時間的延長，氮回收率不斷上升。但水解5 h后，氮回收率上升幅度很小(圖1)。因此，確定5 h為較優(yōu)水解時間。

2.2 底物p H值

5%蛋清粉溶液，溫度為50℃，加酶量為4 000 U·g-1蛋清粉，分別在不同的pH條件下水解5 h。結果 (圖2)表明，pH值為7.0～7.5范圍內(nèi)的氮回收率較高，pH值7.0時最高。因此，確定p H值7.0為最佳底物溶液pH值。

2.3 水解溫度

圖1 水解時間對氮回收率的影響

圖2 底物溶液pH值對氮回收率的影響

5%蛋清粉溶液，pH值7，加酶量為4 000 U·g-1蛋清粉，分別在不同的溫度條件下水解5 h。結果表明，在50～55℃范圍內(nèi)的氮回收率較高，溫度為55℃時氮回收率最高 (圖3)。因此，確定55℃為最佳水解溫度。

圖3 水解溫度對氮回收率的影響

2.4 加酶量

5%蛋清粉溶液，溫度為55℃，pH值7，分別添加不同量的酶，水解5 h。結果 (圖4)表明，加酶量為5 000 U·g-1時氮回收率最高。

2.5 正交試驗

圖4 加酶量對氮回收率的影響

根據(jù)單因子試驗結果，確定水解時間 (A)、底物溶液 pH值 (B)、加酶量 (C)和水解溫度(D)的 1～3水平分別為 4，5，6 h;6.5，7.0，7.5;4 500，5 000，5 500 U·g-1;45，50，55℃。采用正交表L9(34)進行正交試驗，試驗統(tǒng)計分析結果見表1。

表1 各處理組合的氮回收率

極差分析及方差分析結果表明，各因素對氮回收率的影響大小依次為:D＞A＞C＞B，其中因素D對氮回收率的影響顯著 (F=86.38，p＜0.05)。比較各因素的均值 (k1～k3)，確定中性蛋白酶水解蛋清粉的最優(yōu)工藝條件為:A3B2C2D3，即底物溶液pH值為7.0、加酶量為5 000 U·g-1、水解溫度為55℃，水解時間為6 h。驗證試驗證明了此結果，氮回收率為49.22%。

3 小結與討論

通過單因子試驗及正交試驗，確定中性蛋白酶水解制備蛋清蛋白肽的最佳工藝條件為底物溶液pH值為 7.0，加酶量5 000 U·g-1，水解溫度為55℃，水解6 h，氮回收率為49.22%。

預實驗結果表明，5%的蛋清粉溶液穩(wěn)定性較好。高于此濃度時，蛋清粉溶液易形成凝塊;低于此濃度時，所得蛋清蛋白肽溶液含量偏低，不利于后期噴霧干燥［6］。此外，杜永盛考察了不同濃度的咸蛋清對蛋清蛋白氮回收率的影響，證實底物溶液的蛋白濃度為4.5%時，蛋清蛋白的氮回收率最高［1］。這一濃度與本研究蛋清粉溶液中蛋白濃度接近。

由正交試驗結果可知，水解溫度較高 (55℃)時，即使較短的水解時間 (4 h)也可獲得較高的蛋白回收率，因此，可進一步研究水解溫度與時間之間的關系，以獲得最經(jīng)濟的酶水解工藝。此外，與堿性蛋白酶相比，中性蛋白酶對蛋清蛋白的降解效率不同［7］，可考慮進一步研究復合酶 (中性蛋白酶與堿性蛋白酶)水解蛋清蛋白的工藝，以獲得最優(yōu)化的工藝條件。

［1］ 杜永盛.酶解咸鴨蛋蛋清制取白蛋白肽的研究 ［D］.杭州:浙江大學，2006.

［2］ 楊萬根.蛋清蛋白水解物的制備、結構及其生物活性的研究 ［D］.無錫:江南大學，2008.

［3］ Vioque J，Sánchez-Vioque R，Clemente A，et al.Partially hydrolyzed rapeseed protein isolates with improved functional properties ［J］.Journal of the American Oil Chemists'Society，2000，77(4):447-450.

［4］ 鄭云.蛋清蛋白肽生產(chǎn)工藝的研究 ［D］.北京:北京化工大學，2006.

［5］ 遲玉杰，田波.蛋清寡肽制備技術的研究 ［J］.食品科學，2004，25(11):177-179.

［6］ 張治國，王君虹，陳新峰，等.酶解蛋清粉制備蛋清蛋白肽工藝條件研究 ［J］.浙江農(nóng)業(yè)學報，2010，22(2):123-126.

［7］ 劉博群，林松毅，于志鵬，等.基于響應面法優(yōu)化蛋清蛋白質降壓肽的制備工藝 ［J］.食品科學，2009，30(16):172-176.