自由活動小鼠顱內(nèi)腦電記錄在熱性驚厥研究中的應(yīng)用

孔維麟，范元騰，李 亮，彭碧文

(武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系，湖北武漢 430071)

腦電圖(electroencephalogram，EEG)是用現(xiàn)代電子放大技術(shù)，從放置在頭皮上的電極描記出腦神經(jīng)細(xì)胞的自發(fā)生物電活動，通過腦電圖儀加以放大后記錄的腦電波形［1］。腦電圖檢查除能發(fā)現(xiàn)腦器質(zhì)性病變外，主要反映腦神經(jīng)細(xì)胞的電生理功能。EEG不論是在基礎(chǔ)還是臨床研究中，都具有重要的地位。目前專門記錄EEG的實驗儀器價格昂貴，難以廣泛應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)相關(guān)研究，因此需要一種穩(wěn)定可靠且簡便易行的方法來描記EEG。我們經(jīng)過長時間的反復(fù)實驗，用一種目前實驗室廣泛使用的多通道國產(chǎn)儀器，建立了在清醒狀態(tài)下小鼠顱內(nèi)EEG的描記方法，為以后的實驗研究提供簡便、穩(wěn)定可靠的實驗方案。

1 材料與方法

1.1主要儀器材料RM6240BD生物信號采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠)，自制的植入電極，連接導(dǎo)線，江灣腦立體定位儀(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)，青霉素(華北制藥股份有限公司)，STRONG102型顱骨鉆(韓國SAESHIN公司)，玻璃離子體水門汀(上海醫(yī)療器械股份有限公司齒科材料廠)。

1.2實驗動物成年C57BL6J小鼠(70 d齡)30只，♀♂不限，體質(zhì)量30～36 g，由武漢大學(xué)動物實驗中心提供［SCXK(鄂)2008-0004］。

1.3實驗方法

1.3.1電極制備及檢測將不銹細(xì)鋼絲(直徑0.08 mm)在接插件(規(guī)格0.3 mm)的一端緊密纏繞5～6圈，把鋼絲與接插件錫焊連接牢固，剪斷鋼絲，留約5 mm于電極植入端，埋置電極時再根據(jù)實際需要剪成相應(yīng)長度(Fig 1A)。利用接插件制作電極的優(yōu)點是可直接購買獲得，操作簡單、拆卸方便，記錄時只需與配套的接插件連接即可。將自制好的電極植入端用絕緣油漆浸潤，經(jīng)處理后保證植入端能夠與周圍組織絕緣，僅尖端部分能導(dǎo)電。制作好的電極用檢流計檢測是否絕緣和導(dǎo)電。

Fig 1 Hand-made implanted electrode and mouse with implanted electrodes

1.3.2埋植電極用紫外光消毒手術(shù)區(qū)域約30 min，后續(xù)電極植入手術(shù)都在無菌環(huán)境中進(jìn)行。取成年小鼠用氨基甲酸乙酯(20%，1 g·kg-1體重)麻醉完全后，應(yīng)用腦立體定位儀固定小鼠，保持頭部水平。剪去頭部鼠毛，劃開頭部皮膚約1.5 cm，分離皮下組織，剝離刮掉骨膜，暴露顱骨;找到人字縫(lambdoidal suture)，于前囟點(bregma)向后 X=2.30 mm，矢狀縫(sagittal suture)旁Y=2.10 mm，硬膜下Z=2.0 mm定位海馬［2-3］，給予碘伏消毒處理，用顱骨鉆鉆孔，將自制電極經(jīng)消毒后植入海馬;用調(diào)好的玻璃離子體水門汀把電極固定于顱骨(Fig 1B)。手術(shù)后恢復(fù)1周進(jìn)行腦電圖記錄［4］。

1.3.3描記腦電圖將導(dǎo)線連接小鼠海馬左右植入電極的頭外端與信號采集系統(tǒng)，用銀針改制的勾形針狀電極放置頸部皮下作為參考電極。小鼠處于自由活動狀態(tài)，連接導(dǎo)線記錄深部腦電圖，以作分析處理使用。

1.3.4小鼠熱性驚厥與癲癇的誘導(dǎo)

1.3.4.1熱性驚厥模型 采用氣浴方法建立熱性驚厥模型［5-7］。

1.3.4.2青霉素誘導(dǎo)癲癇 小鼠以300萬U·kg-1青霉素腹腔注射致癇。

1.4腦電圖頻段分類RM6240BD生物信號采集處理系統(tǒng)是根據(jù)EEG頻率分為δ、θ、α、β 4個頻段，本實驗結(jié)果系統(tǒng)將自動劃分為δ(1～4 Hz)，θ(4～8 Hz)，α(8～14 Hz)，β(14～30 Hz)，每30 s分析1次。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理利用系統(tǒng)自帶的分析軟件對不同頻段的腦電圖進(jìn)行分析，以得到腦電圖各個頻段的比例，結(jié)果輸出為Excel表并做出線圖。所有數(shù)據(jù)均以±s表示，兩樣本均數(shù)的比較采用t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1正常自由活動狀態(tài)下小鼠的EEG正常清醒狀態(tài)下自由活動的小鼠深部腦電圖以δ波為主(約40.9%，n=10)，平均波幅為(68.3±1.1)μV(n=10)，無癇樣放電;基礎(chǔ)波穩(wěn)定，節(jié)律整齊。正常自由活動狀態(tài)下的小鼠深部腦電圖頻段分布變化較小且表現(xiàn)平穩(wěn)，而皮層腦電圖由于小鼠的活動而受到不同程度的影響，記錄到干擾極大的偽跡(Fig 2)。

2.2小鼠熱性驚厥及癲癇發(fā)作時的腦電圖根據(jù)本實驗室在熱性驚厥的實驗研究中，我們用氣浴成功誘導(dǎo)熱性驚厥模型，結(jié)合小鼠在行為學(xué)上驚厥發(fā)作時的分級，我們觀察到小鼠在未發(fā)作驚厥時深部腦電圖無異常波形，在驚厥發(fā)作時伴有異常放電。波幅在基礎(chǔ)波上增高至(210.4±4.1)μV(n=10)，與正常小鼠腦電波幅差異有顯著性(P＜0.01)，且頻率增快，并偶有棘波、尖波，異常放電呈瞬時、間斷性不規(guī)律放電(Fig 3A，B)。

腹腔注射青霉素誘導(dǎo)小鼠癲癇，可觀察到癲癇發(fā)作時小鼠深部腦電呈現(xiàn)爆發(fā)性高波幅節(jié)律性棘波或棘慢波，在基礎(chǔ)波上有明顯的異常放電，波幅增高至(237.2±5.5)μV(n=10)，與正常小鼠腦電波幅差異有顯著性(P＜0.01)，多見持續(xù)性節(jié)律性棘波、棘慢波或高波幅慢波(Fig 3C)。

Fig 2 EEG recording in hippocampus and cortex on freely moving mouse

Fig 3 Typical intracranial EEG on freely moving mice and their frequency distribution

從實驗結(jié)果可以看出，在小鼠海馬的深部腦電圖中，δ波成分在各種狀態(tài)下分布最為廣泛。通過觀察可以發(fā)現(xiàn)，EEG的波動隨著驚厥或癲癇發(fā)作而出現(xiàn)相應(yīng)的變化。行為學(xué)和EEG動態(tài)表現(xiàn)為:開始須動、咀嚼、耳朵抽動及陣攣，接著出現(xiàn)面部陣攣、節(jié)律性點頭，然后是單肢陣攣，此時腦電活動表現(xiàn)間歇出現(xiàn)高波幅的棘慢波，而且頻率是逐漸增高;達(dá)到Ⅳ—V級的全面性發(fā)作，雙前肢對稱性陣攣、后肢強(qiáng)直而坐立時，高波幅的棘慢波數(shù)量增多，且呈陣發(fā)節(jié)律出現(xiàn);最后四肢強(qiáng)直陣攣、倒地而四肢朝上、或跳躍或翻，棘慢波變寬，波幅增高數(shù)量開始逐漸減少。根據(jù)Jung等［8］研究結(jié)果顯示，海馬區(qū)域置入電極描記大鼠癲癇發(fā)作時腦電圖呈高振幅(＞2×baseline)，高頻率 (＞8 Hz)放電，并跟行為學(xué)觀察相一致;同樣，Chu等［9］在實驗中也得出相似的結(jié)果。

3 討論

本實驗的結(jié)果表明，通過植入電極結(jié)合RM6240BD信號采集處理系統(tǒng)描記小鼠自由活動狀態(tài)下的深部腦電，具有很好的抗干擾效果，同時也避免了由于在活動狀態(tài)下小鼠記錄電極相對位置的改變而引起的腦電圖記錄的誤差，這為其他腦電圖的實驗探究提供很好的方法和技術(shù)參考。為進(jìn)一步驗證植入電極描記腦電圖的穩(wěn)定性，我們制作了氣浴誘導(dǎo)小鼠驚厥模型、青霉素誘導(dǎo)小鼠癲癇模型，通過描記驚厥、癲癇發(fā)作時腦電圖的改變，結(jié)合小鼠行為學(xué)的表現(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)，植入電極可以很好地固定電極相對位置，為實驗提供一個穩(wěn)定可靠的記錄方法;同時，用處死小鼠描記深部腦電圖作為陰性對照，更進(jìn)一步證實該信號采集系統(tǒng)良好的抗干擾功能。

另外，不論是在正常清醒狀態(tài)，還是在驚厥或癲癇發(fā)作狀態(tài)下，小鼠腦電圖的頻段主要分布在δ波，這與人的腦電圖頻段分布有明顯的不同，正常成年人在睜眼或緊張狀態(tài)下腦電圖以β波為主，在額葉和頂葉最為明顯［10］。改變植入電極的位置，其EEG波形仍然以δ波為主。其可能的原因是:人的EEG是在光線和室溫適中、安靜閉目等主動配合狀態(tài)下進(jìn)行，大腦皮質(zhì)放電不受聲、光、熱、冷等外來干擾，此時的EEG所反映的是檢查者大腦皮質(zhì)安靜狀態(tài)下的放電。而小鼠除種屬差異外，由于頭部植入電極，放在一個陌生和有人為干擾的環(huán)境，不免緊張、不能主動閉眼等，因此，偽差因素較多，與人差別較大。

在實驗操作過程中，為提高實驗準(zhǔn)確性，各步操作必須嚴(yán)謹(jǐn)，尤其在植入電極時，需先驗證植入電極位置是否正確，取植入電極的尖端組織進(jìn)行組織學(xué)驗證是否為海馬組織。在連接導(dǎo)線的過程中，做好電磁波的屏蔽，接好地線，把外界干擾盡可能的排除;描記EEG時，減少人員的走動，營造一個安靜舒適的環(huán)境，讓小鼠盡量處于自然的狀態(tài)。在實驗數(shù)據(jù)處理中，使用統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，在選擇數(shù)據(jù)處理過程中盡量避免偽差的選入，確保每份數(shù)據(jù)的真實性。

通過我們對清醒狀態(tài)下描記的正常EEG與麻醉狀態(tài)下的EEG相比，我們發(fā)現(xiàn)，清醒狀態(tài)下描記的EEG跟麻醉狀態(tài)下的一樣穩(wěn)定，不受小鼠活動的影響或是干擾，在癲癇發(fā)作時也能保持穩(wěn)定的描記狀態(tài)，證實植入電極結(jié)合RM6240信號采集處理系統(tǒng)描記深部腦電可作為實驗研究的一個有效方法加以推廣。

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