高效液相色譜法檢測小腸上皮細胞多胺含量

隨晶晶，盧文彪，李茹柳，溫 鵬，胡 燦，趙世清，陳蔚文，2

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405;2上海市高校中醫(yī)內(nèi)科學(xué)E-研究院，上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203)

多胺是一類低分子非蛋白質(zhì)含氮化合物，主要有腐胺(putrescine，Put)、精脒(spermidine，Spd)和精胺(spermine，Spm)。它們廣泛分布在生物組織內(nèi)，具有多種生物學(xué)功能。多胺對腸粘膜上皮細胞的正常生長發(fā)育及損傷后修復(fù)發(fā)揮著重要作用，是上皮細胞不同功能調(diào)節(jié)復(fù)雜信號通路的中心焦點［1-2］。胃腸上皮細胞構(gòu)成胃腸粘膜的保護屏障［3］，胃腸粘膜損傷后存在著修復(fù)過程，多胺對其修復(fù)過程中的細胞遷移、分化、增殖起關(guān)鍵性作用［4］。益氣健脾中藥可通過鳥氨酸脫羧酶和多胺機制，促進其修復(fù)過程中細胞遷移、分化、增殖等環(huán)節(jié)［5-7］。目前，多采用化學(xué)衍生 -高效液相色譜(HPLC)法測定生物樣品中的多胺［8］。常見的衍生化試劑有鄰苯二甲醛、丹酰氯或苯甲酰氯等，對于苯甲酰氯衍生化條件的考察與優(yōu)化，以及IEC-6細胞中同時測定腐胺、精脒和精胺的檢測方法則未見報道。因此建立苯甲酰氯柱前衍生-高效液相色譜法測定細胞內(nèi)多胺含量，觀察陽性對照藥精脒對IEC-6細胞劃痕損傷后多胺含量的影響，為病理生理及藥理研究中檢測該細胞多胺提供參考。

1 儀器與材料

Agilent1200液相色譜系統(tǒng);3111型CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司);Hypersil ODS柱(大連依利特分析儀器有限公司)。

IEC-6細胞(大鼠小腸隱窩細胞，ATCC，Catalog No.CRL-1592，Lot.4988325)。高糖 DMEM(Lot.No.128000-017，GIBCO 公司)、Fetal Bovine Serum(FBS)(Lot.No.7211229，GIBCO 公司);胰酶(Lot.No.2716B052，Ameresco公司)、硫酸慶大霉素(Ameresco公司);胰島素(Cas.No.11070-73-8，Sigma公司);EDTA2Na·2H2O(廣州威佳科技有限公司);腐胺對照品(CAS.No.110-60-1;Lot:S53751459，Sigma公司)、精脒對照品(CAS.No.124-20-9;Lot:0001438791，Sigma公司)、精胺對照品(CAS.No.71-44-3;Lot:1309938，Sigma公司)。色譜甲醇(MERCK公司);超純水(Mili-Q Integral 3制備);其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1多胺對照品的配制分別精密稱取腐胺、精脒、精胺對照品 0.0101 g、0.0189 g、0.0282 g，加色譜甲醇溶解，分別定容于5 ml容量瓶，得腐胺、精脒、精胺濃度分別為 2.29 ×10-2、2.60 ×10-2、2.79×10-2mol·L-1的單一對照品貯備液。分別精密量取3種單一對照品貯備液各1 ml，置于1 L容量瓶中，加色譜甲醇稀釋至刻度，得腐胺、精脒、精胺濃度分別為2.29×10-5、2.60 ×10-5、2.79×10-5mol·L-1的對照品混合溶液。

2.2細胞樣品前處理待IEC-6細胞生長至80%～90%(培養(yǎng)皿底部80% ～90%面積有細胞生長)時，EDTA-胰蛋白酶消化液消化細胞，制作單細胞懸液，4 ×108cell·L-1種植于6 孔板，每孔2 ml。接種24 h后，吸棄培養(yǎng)液，用1 ml移液器吸頭沿孔中央輕輕做一直線劃痕，用PBS緩沖液沖洗細胞表面3次以去除細胞殘骸和碎片?？瞻捉M加入完全培養(yǎng)基每孔2.5 ml cDMEM;精脒組每孔2.5 ml cDMEM(含精脒5 μmol·L-1，簡稱 SPD組)。每組6個復(fù)孔，合并2個復(fù)孔的細胞為一個樣，即每組3個樣。體積分數(shù)為0.05的CO2，體積分數(shù)為0.95的空氣，飽和濕度下37℃培養(yǎng)12 h后，棄廢液，PBS沖洗2次，每孔加入胰酶-EDTA消化液0.2 ml，37℃孵育5 min，每孔加入0.2 ml cDMEM終止消化后，轉(zhuǎn)移細胞懸液至1.5 ml EP管。3 000 r·min-1離心5 min，棄上清;加入PBS重懸后3 000 r·min-1離心5 min，棄上清;再次加入1 ml PBS重懸，取10 μl轉(zhuǎn)移至EP管內(nèi)用于細胞計數(shù)，余下細胞懸液3 000 r·min-1離心5 min，棄上清后加入冷高氯酸(體積分數(shù)為 0.05)1.2 ml，混勻后 4℃、1 4000 r·min-1離心10 min。取上清液，供衍生化處理。

2.3衍生化處理取待測樣品溶液1 ml，分別加入2 mol·L-1的氫氧化鈉溶液1 ml和苯甲酰氯5 μl(含量≥96%)，渦旋混合后放置20 min，再加入飽和氯化鈉溶液2 ml和氯仿2 ml，渦旋混合1 min，3 000 r·min-1離心 10 min，吸取下層 1.5 ml有機相并氮氣吹干。殘渣用0.5 ml的流動相溶解在帶有螺蓋的玻璃管中，50℃下水浴保溫8 h，所得溶液分別加入2 mol·L-1氫氧化鈉溶液0.2 ml及氯仿2 ml，渦旋混合 1 min，3 000 r·min-1離心 10 min，吸取下層1.5 ml有機相并氮氣吹干，殘渣用0.5 ml流動相溶解，經(jīng)0.22 μm有機微孔濾膜濾過，按擬定條件進樣測定。

2.4色譜條件及專屬性驗證ODS-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);檢測波長:234 nm;柱溫:25℃;流動相 ∶甲醇 ∶水(55∶45);流速:1.0 ml·min-1;進樣量:20 μl。在建立的色譜條件下測定，各成分峰分離良好，腐胺、精脒和精胺的保留時間分別為7.2、13.7、27.6 min。細胞樣品未加衍生劑和衍生劑未加細胞樣品處理后，無相應(yīng)的色譜峰出現(xiàn)。結(jié)果見Fig 1～3。

2.5衍生化溫度考察按“2.3衍生化處理”項下方法，考察水浴溫度分別為35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃時多胺的峰面積。結(jié)果見Tab 1。

Fig 1 HPLC chromatogram of polyamines after derivation

Fig 2 HPLC chromatogram of cell sample without derivative reagent

Fig 3 HPLC chromatogram of derivative reagent without cell sample

Tab 1 Polyamines peak areas in different water-bath temperature(xˉ±s，n=4)

2.6衍生時間的考察按“2.3衍生化處理”項下方法，考察水浴保溫時間分別為 1、2、4、6、8、10、12、14、16 h時的多胺峰面積(n=4)。結(jié)果見Fig 4。

Fig 4 Polyamines peak areas in different water-bath time

2.7線性范圍取對照品混合液(含腐胺4.80×10-5mol·L-1、精脒 4.065 × 10-5mol·L-1、精胺7.11 ×10-5mol·L-1)1 ml，按“2.3衍生化處理”項下方法處理，分別進樣 1、2、5、10、15、20 和 25 μl進行測定，以衍生化前樣品溶液濃度折算進樣量(10-10mol)與峰面積進行回歸，腐胺、精脒和精胺的回歸方程分別為^Y=8.2081X-0.5537，r2=0.9996;^Y=7.5388X-0.4558，r2=0.9995;^Y=6.3143X-0.2091，r2=0.9996，腐胺在0.054 ～1.35 nmol、精脒在 0.046 ～1.15 nmol、精胺在 0.080 ～2.00 nmol范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.8精密度實驗分別精密配制對照品混合液高、中、低3個濃度，高濃度(含腐胺4.80×10-5mol·L-1;精脒4.065×10-5mol·L-1;精胺7.11×10-5mol·L-1);中濃度(含腐胺 3.20 ×10-5mol·L-1;精脒2.71 ×10-5mol·L-1;精胺 4.74 ×10-5mol·L-1);低濃度(含腐胺1.60×10-5mol·L-1;精脒1.355×10-5mol·L-1;精胺 2.37 ×10-5mol·L-1)。按“2.3”項下方法處理，測定峰面積，日內(nèi)精密度:高、中、低濃度樣品各制備5份，當日測定1次;日間精密度:高、中、低濃度樣品每隔24h測定1次，共測定3次。結(jié)果見Tab 2，3。

Tab 2 The intra-day precision of polyamines(n=5)

Tab 3 The inter-day precision of polyamines(n=5)

2.9回收率實驗分別精密配制對照品混合液高、中、低3個濃度(同“2.8”項下)，按“2.3”項下方法處理，測定，用標準曲線計算。結(jié)果見Tab 4～6。

Tab 4 The method recoveries of putrescine(n=6)

Tab 5 The method recoveries of spermidine(n=6)

Tab 6 The method recoveries of spermine(n=6)

2.10細胞樣品測定細胞樣品按“2.2”和“2.3”項下方法處理，測定。結(jié)果見Tab 7。

Tab 7 The polyamines contents in cell cultivated with spd.for 12 h(±s，n=3)

Tab 7 The polyamines contents in cell cultivated with spd.for 12 h(±s，n=3)

＊＊P＜0.01 vs control

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3 討論

多胺的衍生化條件考察結(jié)果表明，溫度對多胺的苯甲?；绊戄^大，40℃時精脒和精胺測定結(jié)果的重復(fù)性較差，原因尚不明確，可能與該溫度下較有利于多胺之間的酶促轉(zhuǎn)化有關(guān)［2］;而在60℃時，副反應(yīng)增加，主要表現(xiàn)為對腐胺色譜峰分離度的影響，干擾測定。測定的多胺峰面積隨樣品的衍生化時間而變化較大，8 h時出現(xiàn)峰值，隨后又下降，這可能是多胺與苯甲酰氯之間的副反應(yīng)造成的，確切原因還有待深入研究。綜合考慮，選用50℃為衍生化溫度、8 h為衍生化時間。

方法學(xué)考察和細胞樣品測定結(jié)果表明，建立的多胺(腐胺、精脒和精胺)含量測定方法具有較好的準確性，且較靈敏、簡便，可作為細胞中多胺的分析檢測方法用于研究多胺對小腸上皮細胞增殖、遷移、分化、凋亡等方面的影響，以及研究藥物通過對多胺影響而發(fā)揮的藥理作用等方面。

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