脂多糖激活補(bǔ)體誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞釋放黏附分子和凋亡

沈良賢，李 敏，孫黔云，石京山

(1.貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng) 550002;2.遵義醫(yī)學(xué)院，貴州遵義 563000;3.貴州省人民醫(yī)院呼吸疾病研究所，貴州貴陽(yáng) 550002)

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的正常結(jié)構(gòu)成分，臨床上又稱(chēng)為內(nèi)毒素。在嚴(yán)重創(chuàng)傷、感染等應(yīng)激狀態(tài)下，大量?jī)?nèi)毒素釋放入血，從而啟動(dòng)炎癥和損傷，導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥、全身炎癥反應(yīng)綜合征、感染性休克和多器官功能障礙綜合征等病癥。LPS具有多種病理生理效應(yīng)。有研究表明，LPS能夠激活補(bǔ)體［1-2］。補(bǔ)體是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，廣泛參與機(jī)體防御反應(yīng)以及免疫調(diào)節(jié)［3-4］，其過(guò)度激活在炎癥反應(yīng)的初始階段起著啟動(dòng)、放大和效應(yīng)的作用，通過(guò)抑制補(bǔ)體能有效減輕組織損傷程度［5］。迄今，LPS影響內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)功能的研究頗多，但LPS激活補(bǔ)體對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的作用極少見(jiàn)報(bào)道。為進(jìn)一步了解病理生理情況下LPS激活血清補(bǔ)體對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的影響，加深對(duì)相關(guān)疾病機(jī)制的認(rèn)識(shí)以及為補(bǔ)體抑制劑的篩選評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)，本工作開(kāi)展了LPS激活補(bǔ)體作用于內(nèi)皮細(xì)胞的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1材料人微血管內(nèi)皮細(xì)胞株HMEC由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng);眼鏡蛇毒因子 (cobra venom factor，CVF)的制備、補(bǔ)體活性的測(cè)定參照文獻(xiàn)［6-7］;LPS(Esherichia coli O111:B4)、兔抗綿羊紅細(xì)胞抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;SRB(Sulforhodamine B)是東京化成工業(yè)株式會(huì)社產(chǎn)品;Caspase-3/7試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司;人 P-selectin、E-selectin和 ICAM-1 ELISA試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物有限公司;正常人血清(normal human serum，NHS)由本實(shí)驗(yàn)室健康志愿者獻(xiàn)血制備而得;滅活人血清(inactivated normal human serum，INHS)由NHS經(jīng)56℃處理30 min而得;其它試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2儀器Nikon TS100倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司);Molecular Devices Spectra MAX-190連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)MD公司);Forma 3111型 CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司);5810R冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司);GloMax發(fā)光檢測(cè)儀(美國(guó)Promega公司)。

1.3方法

1.3.1HMEC的培養(yǎng)HMEC用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2LPS激活血清補(bǔ)體的作用

1.3.2.1LPS對(duì)經(jīng)典途徑的激活 將不同濃度的LPS、NHS 各 15 μl混合后于 37℃ 預(yù)孵 2 h;取 LPS(400 mg· L-1)與 NHS各15 μl混合后于37℃預(yù)孵不同時(shí)間，分別取10 μl孵育混合物加入90 μl的GGVB(葡萄糖巴比妥明膠緩沖液)，再加入100 μl致敏綿羊紅細(xì)胞(5 ×1011cells· L-1)，37℃孵育30 min后，加入1 ml冷生理鹽水終止反應(yīng)，2 000 r·min-1離心10 min，取上清于412 nm測(cè)定吸光值。

1.3.2.2LPS對(duì)替代途徑的激活 將不同濃度的LPS、NHS 各24 μl混合后于 37°C 預(yù)孵 2 h;取 LPS(800 mg· L-1)與 NHS 各 24 μl混合后于 37°C 預(yù)孵不同時(shí)間，分別取40 μl孵育混合物加入60 μl的GVB(巴比妥明膠緩沖液)，再加入100 μl兔紅細(xì)胞(1.5 × 1011cells· L-1)，37°C 孵育 30 min 后，加入0.5 ml冷生理鹽水終止反應(yīng)，2 000 r· min-1離心10 min，取上清于412 nm測(cè)定吸光值。

1.3.3LPS激活血清補(bǔ)體活化HMEC的條件將HMEC 以5 ×107cells· L-1接種于 96 孔板，90 μl/孔，培養(yǎng)48 h后加入孵育混合物(NHS體積分?jǐn)?shù)為5%、10%，15%、20%、25% 和 30%)，37℃ 培養(yǎng)20 min;在另一組實(shí)驗(yàn)中加入NHS體積分?jǐn)?shù)為20%的孵育混合物，37℃分別培養(yǎng) 5、10、20、30、60 min。取細(xì)胞上清，2 000 r· min-1離心10 min，取上清液按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定P-selectin。

1.3.4LPS激活血清補(bǔ)體對(duì)HMEC表達(dá)黏附分子的影響將HMEC以5×107cells· L-1接種于96孔板，90 μl/孔，培養(yǎng)48 h后加入血清體積分?jǐn)?shù)為20%的孵育混合物，37℃培養(yǎng)不同時(shí)間后，取細(xì)胞上清，2 000 r· min-1離心10 min，取上清液按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定 P-selectin、E-selectin和 ICAM-1。以CVF激活血清補(bǔ)體作為本實(shí)驗(yàn)的平行對(duì)照。

1.3.5LPS激活血清補(bǔ)體誘導(dǎo)HMEC凋亡的情況HMEC以5×107cells· L-1接種于96孔板，90 μl/孔，培養(yǎng)48 h后加入血清體積分?jǐn)?shù)為20%的孵育混合物，再培養(yǎng)24 h，按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)Caspase-3/7活性。以CVF激活血清補(bǔ)體作為本實(shí)驗(yàn)的平行對(duì)照。

1.3.6LPS激活血清補(bǔ)體對(duì)HMEC生長(zhǎng)的影響將HMEC以5×107cells· L-1接種于96孔板，90 μl/孔，培養(yǎng)48 h后加入血清體積分?jǐn)?shù)為20%的孵育混合物，37℃培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 10% 的 TCA 100 μl/孔，4℃ 固定 1 h，棄去，雙蒸水輕輕洗5次，加入體積分?jǐn)?shù)為1%的醋酸配置的 4 g· L-1的 SRB，100 μl/孔，室溫染色15 min，棄去，用體積分?jǐn)?shù)為1%的醋酸洗5次，晾干，加10 mmol· L-1Tris 溶液 150 μl/孔，溶解后于 570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。以CVF激活血清補(bǔ)體作為本實(shí)驗(yàn)的平行對(duì)照。

1.3.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果以±s表示，全部數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1LPS激活血清補(bǔ)體的作用LPS在預(yù)孵條件下，能激活補(bǔ)體經(jīng)典途徑和替代途徑，這種激活具有劑量和時(shí)間依賴(lài)性(Fig 1)。在預(yù)孵2 h的條件下，對(duì)經(jīng)典途徑和替代途徑溶血的IC50分別為118.48、195.82 mg· L-1。

2.2LPS激活血清補(bǔ)體活化HMEC的情況LPS和NHS共同孵育后作用于HMEC，結(jié)果顯示，P-selectin瞬時(shí)釋放增加，呈現(xiàn)量效依賴(lài)性(Fig 2)。

2.3LPS激活血清補(bǔ)體對(duì)HMEC表達(dá)黏附分子的影響實(shí)驗(yàn)中LPS和NHS孵育后作用HMEC，使P-selectin瞬時(shí)釋放增加，E-selectin、ICAM-1表達(dá)明顯上調(diào)(Fig 3)。

Fig 1Effect of LPS on complement activation(±s，n=3)

Fig 2 Effect of incubation mixture of LPS and NHS on inducing HMEC to release P-selectin(±s，n=3).

2.4LPS激活血清補(bǔ)體誘導(dǎo)HMEC凋亡的情況

與INHS和LPS+INHS比較〔凋亡信號(hào)分別為(269 125.30±51 949.59)RLU、(273 239.20±26 454.41)RLU〕，LPS激活血清補(bǔ)體可導(dǎo)致 HMEC Caspase-3/7的活性信號(hào)明顯增強(qiáng)［(368374.3±19187.67)RLU］(Fig 4)。值得注意的是，單獨(dú)的LPS可誘導(dǎo)Caspase-3/7信號(hào)明顯增強(qiáng)［(1538748±118721.20)RLU］。

2.5LPS激活血清補(bǔ)體對(duì)HMEC生長(zhǎng)的影響在本實(shí)驗(yàn)選擇的條件下，LPS激活血清補(bǔ)體后對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)未產(chǎn)生明顯抑制，各組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(數(shù)據(jù)未列出)。

3 討論

脂多糖在敗血癥等一系列病癥的發(fā)生中起重要作用，通過(guò)識(shí)別特異性細(xì)胞受體激活體內(nèi)多種效應(yīng)細(xì)胞，釋放細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)，產(chǎn)生一系列病理生理效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS激活補(bǔ)體具有量效、時(shí)效性，其激活產(chǎn)物能影響內(nèi)皮細(xì)胞的功能，刺激P-selectin、E-selectin、ICAM-1的表達(dá)和凋亡的發(fā)生。

本研究通過(guò)LPS激活血清補(bǔ)體的量效、時(shí)效關(guān)系，確定了LPS激活血清補(bǔ)體的劑量和作用時(shí)間，在此基礎(chǔ)上，通過(guò)測(cè)定血管內(nèi)皮細(xì)胞活化重要指標(biāo)P-selectin的釋放情況，最終確立了LPS激活補(bǔ)體活化內(nèi)皮細(xì)胞的合適條件。

Fig 3 Effect of incubation mixture of LPS and NHS on inducing HMEC to release P-selectin，E-selectin and ICAM-1(±s，n=3)

Fig 4 Apoptosis of HMEC induced by incubation mixture of LPS and NHS(±s，n=3).*P＜0.05 vs INHS;#P＜0.05 vs LPS+INHS

本實(shí)驗(yàn)顯示，LPS激活血清補(bǔ)體能引起HMEC活化，明顯表達(dá)P-selectin、E-selectin和ICAM-1。P-selectin和E-selectin是選擇素家族中的重要成員，P-selectin主要分布于內(nèi)皮細(xì)胞和血小板，主要介導(dǎo)粒細(xì)胞和單核細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞表面滾動(dòng)和最初結(jié)合，啟動(dòng)炎癥的早期反應(yīng)［8］。E-selectin主要分布于活化的內(nèi)皮細(xì)胞，具有促進(jìn)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附，向炎癥部位游走的功能。ICAM-1屬于免疫球蛋白超家族中的成員之一，引起炎癥細(xì)胞牢固黏附并跨內(nèi)皮移行至血管外，參與炎癥的發(fā)生發(fā)展［9］。上述情況提示LPS激活血清補(bǔ)體具有促進(jìn)中性粒細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞黏附、聚集、游出的作用，從而啟動(dòng)、加重?fù)p傷部位的炎癥反應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)中我們檢測(cè)到Caspase-3/7活化明顯增強(qiáng)的信號(hào)。Caspase家族在凋亡程序的啟動(dòng)和執(zhí)行過(guò)程中，起著非常重要的作用，直接參與凋亡的早期啟動(dòng)、凋亡信號(hào)傳遞及凋亡晚期事件。Caspase-3/7是凋亡晚期表達(dá)的關(guān)鍵酶，其一旦活化，凋亡的發(fā)生就不可逆轉(zhuǎn)。從實(shí)驗(yàn)中可以看到，CVF激活補(bǔ)體出現(xiàn)了明顯的凋亡信號(hào)，說(shuō)明補(bǔ)體激活確實(shí)能誘導(dǎo)凋亡，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致［10］。LPS與NHS孵育組和對(duì)照組(LPS+INHS)相比，凋亡信號(hào)有明顯增強(qiáng)，說(shuō)明LPS激活的補(bǔ)體明確誘導(dǎo)了凋亡。值得注意的是，單獨(dú)的LPS能誘導(dǎo)強(qiáng)烈凋亡，但通過(guò)比較LPS組與LPS+INHS組以及正常細(xì)胞對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明血清幾乎可以完全抑制LPS自身所能誘導(dǎo)的凋亡。同時(shí)，也提示由LPS本身所誘導(dǎo)的這種凋亡在體內(nèi)血液環(huán)境下不太可能發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)采用能特異激活補(bǔ)體替代途徑的CVF作為平行對(duì)照，考察激活血清補(bǔ)體對(duì)HMEC的作用和影響。CVF是來(lái)源于眼鏡蛇毒的一種高效補(bǔ)體激活蛋白，在正常血清中可與B因子形成具有C3/C5轉(zhuǎn)化酶活性的CVFBb，導(dǎo)致補(bǔ)體替代途徑持續(xù)激活，產(chǎn)生大量C3a、C5a及攻膜復(fù)合物(membrane attack complex，MAC)。CVF作為一個(gè)常用的補(bǔ)體研究工具，激活補(bǔ)體與體內(nèi)補(bǔ)體激活高度相似，可用于模擬機(jī)體在病理狀態(tài)下補(bǔ)體替代途徑的過(guò)度激活狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)顯示，LPS激活血清補(bǔ)體作用于內(nèi)皮細(xì)胞的效應(yīng)與CVF激活血清補(bǔ)體類(lèi)似，提示LPS激活血清補(bǔ)體也產(chǎn)生了C3a、C5a和MAC。

本研究通過(guò)LPS激活補(bǔ)體作用內(nèi)皮細(xì)胞，模擬病理生理情況下體內(nèi)LPS對(duì)靶細(xì)胞的作用情況，表明LPS激活補(bǔ)體能活化和損傷內(nèi)皮細(xì)胞，明顯上調(diào)黏附分子表達(dá)，并誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。本工作有助于加深對(duì)補(bǔ)體相關(guān)疾病機(jī)制的認(rèn)識(shí)和理解，為相關(guān)臨床治療策略、新藥研究提供有益的思路和參考。

［1］劉振元，吳安然.內(nèi)毒素、補(bǔ)體系統(tǒng)與彌漫性血管內(nèi)凝血［J］.國(guó)際免疫學(xué)雜志，1982，3:139-44.

［1］Liu Z Y，Wu A R.Endotoxin，complement system and disseminated intravascular coagulation［J］.Inter J Immunol，1982，3:139-44.

［2］Zhao L，Ohtaki Y，Yamaguchi K，et al.LPS-induced platelet response and rapid shock in mice:contribution of O-antigen region of LPS and involvement of the lectin pathway of the complement system［J］.Blood，2002，100:3233-9.

［3］Roozendaal R，Carroll M C.Emerging patterns in complement-mediated pathogen recognition［J］.Cell，2006，125(1):29-32.

［4］Fearon D T，Locksley R M.The instructive role of innate immunity in the acquired immune response［J］.Science，1996，272(5258):50-3.

［5］Morgan B P，Harris C L.Complement therapeutics;history and current progress［J］.Mol Immunol，2003，40(2-4):159-70.

［6］Sun Q Y，Chen G，Guo H，et al.Prolonged cardiac xenograft survival in guinea pig-to-rat model by a highly active cobra venom factor［J］.Toxicon，2003，42(3):257-62.

［7］孫黔云，王婉瑜，熊郁良.眼鏡蛇毒高活性抗補(bǔ)體因子的體外溶血活性研究［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2003，19(8):909-13.

［7］Sun Q Y，Wang W Y，Xiong Y L.In vitrohemolyzation of a highly active anticomplement factor from the venom ofNaja kaouthia［J］.Chin Pharmacol Bull，2003，19(8):909-13.

［8］Lorant D E，Topham M K，Whatley R E，et al.Inflammatory roles of P-selectin［J］.J Clin Invest，1993，929(2):559-70.

［9］Albelda S M，Smith C W，Ward P A.Adhesion molecules and inflammatory injury［J］.FASEB J，1994，8(8):504-12.

［10］Tsuji S，Kaji K，Nagasawa S.Activation of the alternative pathway of human complement by apoptotic human umbilical vein endothelial cells［J］.J Biochem，1994，116(4):794-800