周邊γ-氨基丁酸通過GABAB受體調(diào)控骶髓后聯(lián)合核神經(jīng)元谷氨酸能突觸

馬紅雨，林 凱，羅 丹，呂建曉，楊 鯤

(1.空軍總醫(yī)院臨床檢驗中心，北京 100142;2.第四軍醫(yī)大學解剖學教研室暨梁球鋸腦研究中心，陜西 西安 710032;3.美國馬里蘭大學生理系，巴爾地摩 21201，美國)

骶髓后聯(lián)合核(sacral dorsal commissural nucleus，SDCN)位于脊髓灰質(zhì)腰骶段中央管后外側(cè)。在大鼠，SDCN出現(xiàn)在腰6(L6)至骶4(S4)段，是接受軀體感覺和內(nèi)臟感覺初級傳入的重要部分，并將初級傳入信息向?qū)?cè)脊髓以上核團投射［1］。谷氨酸是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)最重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。SDCN神經(jīng)元接受廣泛的谷氨酸能傳入［1］。而γ-氨基丁酸(GABA)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的抑制性神經(jīng)活性物質(zhì)。在脊髓，GABA受體分為離子型GABAA受體和代謝型GABAB受體兩種［2］。在成年哺乳動物，GABAA受體被激活后，引起氯離子(Cl-)通道開放，導致胞外的Cl-內(nèi)流，神經(jīng)元超極化，進而抑制神經(jīng)元的活動［3］。與GABAA受體等離子門控型受體不同，GABAB受體屬于具有7個跨膜區(qū)段并與胞內(nèi)G蛋白偶聯(lián)的代謝型受體［3］。形態(tài)學研究表明［4-5］，GABAB受體在脊髓背角和SDCN均有廣泛表達。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和脊髓，于突觸結(jié)構(gòu)(突觸前膜、突觸后膜、突觸間隙)外，存在一定水平的周邊神經(jīng)活性物質(zhì)(ambient neuroactivities)。這些神經(jīng)活性物質(zhì)，可能參與突觸遞質(zhì)釋放的調(diào)節(jié)［6］。在脊髓背角和 SDCN，GABAB受體被其外源性受體激動劑激活，進而調(diào)節(jié)突觸前遞質(zhì)釋放和突觸后神經(jīng)元興奮性已有很多研究［4，7-8］。但存在于突觸周邊的內(nèi)源性GABA是否通過對谷氨酸能突觸上的GABAB受體的影響，進而調(diào)節(jié)谷氨酸釋放，尚不清楚。本實驗擬用電生理學方法研究上述問題。

1 材料與方法

1.1標本制作實驗動物為5～8周成年♂Sprague-Dawley(SD)大鼠。脊髓薄片制作方法如前所述［7，9-10］:用烏拉坦將動物腹腔注射麻醉(1.5 g·kg-1體質(zhì)量)，沿背正中線由骶髓水平向上至胸髓水平剪開皮膚，以組織剪沿椎骨棘突兩側(cè)剪開肌肉，暴露橫突，行椎板切除術(shù)，小心暴露脊髓。將脊髓于胸段水平橫斷，向下至全骶髓連同蛛網(wǎng)膜和軟膜一并取出，迅速置于冷的人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF)中。除去蛛網(wǎng)膜和軟膜，修剪去前根和背根。振動切片機(DTK-1 000，Dosaka EM，日本)切取厚度為500 μm的腰骶部位脊髓橫切薄片。將標本轉(zhuǎn)移到記錄槽中，ACSF液持續(xù)灌流(速度～10 ml·min-1;(36±1)℃。預孵育30 min開始記錄。

1.2藥品與溶液GABAB受體特異性拮抗劑3-［［［(3，4-dichlorophenyl)methyl］amino］propyl］(diethoxy-methyl)phosphinic acid(CGP52432)，河豚毒素 (tedrodotoxin，TTX)，6-cyano-7-nitroquinoxaline-2，3-dione(CNQX)，GABAA受體拮抗劑 picrotoxin和胞內(nèi)G蛋白偶聯(lián)受體阻斷劑guanosine 5'-［β-thio］diphosphate trilithium salt(GDP-βS)均購自 Sigma公司(美國)。其他藥品購自試劑公司。ACSF成分為(mmol·L-1):NaCl 117，KCl 3.6，CaCl22.5，MgCl21.2，NaH2PO41.2，NaHCO325，glucose 11，picrotoxin 0.05。記錄電極細胞內(nèi)液成分為(mmol·L-1):K-gluconate 135，KCl 5，CaCl20.5，MgCl22，EGTA 5，Hepes 5，Mg-ATP 3.6，GDP-βS 1。電極內(nèi)液中的GDP-βS能夠抑制被記錄神經(jīng)元(突觸后神經(jīng)元)胞內(nèi)G蛋白，以排除突觸后GABAB受體的作用［7-8］。

1.3全細胞記錄與給藥方式標本置于灌流槽內(nèi)，以一銀絲纏繞細尼龍線作成的“U”字型錨固定薄片。以“盲插法”(blind patch)形成全細胞電壓鉗記錄，封接方法如另文詳述［9］。在鉗制電壓為 -70 mV時，一般可以觀察到自發(fā)的興奮性突觸后電流(spontaneous excitatory postsynaptic currents，sEPSCs)。當外液加入河豚毒素 (0.5 μmol·L-1)時，可記錄到的微小突觸后電流 (miniature EPSCs，mEPSCs)［7，9］。使用同心圓電極給予點刺激(focal stimulation)時，可直接激活突觸前終末，引起興奮性突觸后電流 (evoked excitatory postsynaptic currents，eEPSCs)［11］。模式/數(shù)字信號轉(zhuǎn)換系統(tǒng)和記錄軟件分別為 Digidata 1200A analog/digital interface和pClamp 6(均購自Axon Instruments)。

實驗前將藥物用蒸餾水或二甲基亞砜(DMSO)制成1 000～5 000倍濃度儲備液。使用前，以ACSF稀釋至終濃度。采用灌流方式給藥，分別記錄給藥前(對照組)，給藥后(實驗組)及洗脫后的電流變化。

1.4數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學分析實驗結(jié)果用Axo-Graph 4.0(Axon Instruments)或Clamp Fit 8.0(Molecular Devices，美國)分析。數(shù)據(jù)在Stat View(Apple McIntosh，美國)或 Sigma Plot 9.0(Sigma Plot，美國)上進行計算和統(tǒng)計學比較。數(shù)值以±s表示。n代表實驗的細胞數(shù)目。結(jié)果處理用Student’st-test(t檢驗)、χ2檢驗或 Kolmogorov-Smirnov test(K-S檢驗)。

2 結(jié)果

2.1抑制突觸前GABAB受體導致刺激引起的興奮性突觸后電流(eEPSCs)幅度增加鉗制電壓為-70 mV 時，突觸前刺激(100 μs，0.033 Hz)在一定強度下(3～20 V)，可誘導出穩(wěn)定的興奮性突觸后電流eEPSCs。記錄5 min穩(wěn)定的對照電流后，灌流GABAB受體特異性受體阻斷劑CGP52432(1 μmol·L-1，8 ～ 10 min)［3］。如 Fig 1A 所示，CGP52432增加eEPSCs的幅度。在所有被觀察的11個神經(jīng)元上，CGP52432灌流8 min增加eEPSCs的幅度至對照水平的(141±18)%(P＜0.05，pairedt-test)(Fig 1B)。CGP52432的易化作用，經(jīng)洗脫后可部分恢復。

我們的既往研究表明［4，7，9］，GABAB受體特異性激動劑氯苯氨丁酸(baclofen)減少微小興奮性突觸后電流mEPSCs。本實驗進一步觀察到，CGP52432(1 μmol·L-1，10 ～15 min)對 mEPSCs的頻率或幅度分布均無影響(K-S檢驗):平均頻率在對照組為(3.1±1.0)Hz，CGP52432灌流后為對照數(shù)值的(107±10)%;平均幅度在對照組為(21.3±8.2)pA，CGP52432處理后為對照水平的(99±7)%(兩組均為P＞0.05，t檢驗，n=13)(Fig 1C)。以上結(jié)果表明，以CGP52432阻斷谷氨酸能突觸前GABAB受體，導致eEPSCs幅度增加(即谷氨酸釋放增加)，但是對自發(fā)微小突觸電流無明顯影響。

2.2突觸前GABAB受體參與eEPSCs幅度增加為進一步確認CGP52432是否作用于突觸前GABAB受體，我們選用了同心圓電極間隔刺激法:當兩次刺激間隔為50 ms、頻率為0.033 Hz、鉗制電壓為-70 mV時，可以觀察到同心圓刺激電極刺激引起的配對刺激比率(paired-pulse ratio;PPR)(Fig 2A)。對照組eEPSCs的PPR(P2/P1)為(0.78±0.07)，灌流 CGP52432(1 μmol·L-1，8 ～10 min)使PPR值變?yōu)?.65±0.09，較對照值增大(P＜0.05，n=12)(Fig 2B)。提示CGP52432增加刺激引起的谷氨酸釋放的作用部位是突觸前GABAB受體。

2.3抑制突觸前GABAB受體導致沉默突觸功能恢復上述結(jié)果表明，阻斷突觸前GABAB受體可增加谷氨酸釋放，本實驗進而研究該效應是否可以將谷氨酸能的沉默突觸(silent synapse)變成活躍突觸(active synapse)。我們首先尋找沉默突觸。方法如前所示［12］:以同心圓電極進行雙刺激(間隔為50 ms)，在一定強度下，可找到第1個刺激沖動誘發(fā)eEPSCs;逐漸降低刺激強度，一般在閾強度90%左右，可找到符合下列標準的沉默突觸:①第1個eEPSCs至少連續(xù)20次刺激經(jīng)目視檢查，無可分辨的幅度(沉默突觸);② 第2個eEPSCs偶然出現(xiàn)。此種類型沉默突觸一般認為是因為第1個刺激引起的遞質(zhì)釋放不足而引起的“突觸前沉默”［12］。如Fig 3A所示，沉默突觸在灌流CGP52432后部分恢復功能成為活躍突觸 (active synapse)。CGP52432引起第1個突觸的平均幅度和誘發(fā)eEPSCs成功率均有明顯增高(Fig 3B)。在13個被檢測的“突觸前沉默”的神經(jīng)元中，CGP52432灌流8 min后，11例轉(zhuǎn)變?yōu)榛钴S突觸(P＜0.05，χ2檢驗)。

Fig 1 Evoked excitatory postsynaptic currents in SDCN neuron enhanced by blockade of GABABreceptors by CGP52432

3 討論

本研究通過用藥理學方法先阻斷突觸后SDCN神經(jīng)元 GABAB受體，排除突觸后作用后，再以CGP52432阻斷位于谷氨酸能突觸前的GABAB受體，觀察到刺激引起的谷氨酸釋放增加，且此易化作用發(fā)生在突觸前。結(jié)果提示，在SDCN，突觸周邊存在的GABA通過GABAB受體，對谷氨酸釋放起限制作用。

Fig 2 Paired-pulse ratio decreased by CGP52432.

大部分神經(jīng)遞質(zhì)在神經(jīng)元胞體合成后，運輸至突觸前末梢，參與遞質(zhì)釋放。被釋放的遞質(zhì)部分與突觸后膜上的受體結(jié)合，部分經(jīng)過重攝取(re-uptake)再次進入突觸前膜，還有部分溢出(spillover)突觸結(jié)構(gòu)，成為周邊神經(jīng)活性物質(zhì)。分布在突觸周邊存在的抑制性神經(jīng)活性物質(zhì)對突觸起著緊張性調(diào)節(jié)(tonic modulation)作用。周邊GABA的來源，至少有兩個:除上述的溢出外，最新研究表明膠質(zhì)細胞也可能釋放GABA［13］。本研究中，尚不能判斷周邊GABA的具體來源。

Fig 3 A presynaptic silent neuron becoming active to application of CGP52432

經(jīng)典神經(jīng)電生理學通過對PPR的分析，可以判定某種特定藥物的作用部位(突觸前或突觸后)。在PPR實驗中，由于兩次刺激間隔的時間短，實施第2次刺激時，突觸前已經(jīng)流入的Ca2+還處于較正常為高的水平，影響第2次刺激引起的Ca2+內(nèi)流，因而第2次刺激引起的變化小。給予某種藥物時，如果對第1次刺激的相對作用大于對第2次刺激的相對作用，則可以判斷為突觸前作用。本實驗中，CGP52432明顯降低PPR的比率，因而推斷增加谷氨酸釋放的作用位點為突觸前GABAB受體。令人感興趣的是，CGP52432阻斷GABAB受體，卻對靜息條件下的微小突觸電流(mEPSCs)沒有影響(Fig 1C)，提示上述的調(diào)節(jié)作用只存在于突觸前動作電位誘發(fā)的谷氨酸釋放。

需要指出的是，脊髓SDCN神經(jīng)元的突觸前和突觸 后 均 有 GABAB受 體 分 布［4-5］，因 而 用CGP52432可能對突觸前后的GABAB受體后都產(chǎn)生作用。在本實驗中，突觸后GABAB受體的作用被通過記錄電極施與的 GDP-βS 阻斷［4，8，11］，因而可以排除GABAB受體的突觸后作用。

SDCN接受廣泛的初級傳入，其中部分傳入介導傷害性軀體感覺與內(nèi)臟感覺信息。這些信息經(jīng)過SDCN，由投射神經(jīng)元再進一步向延髓和丘腦等目標核團投射［1］。本研究中發(fā)現(xiàn)的周邊 GABA通過GABAB受體影響谷氨酸的釋放，很可能參與這種傷害性信息傳遞的調(diào)制。GABAB受體在影響突觸前興奮性谷氨酸釋放的同時，也能調(diào)節(jié)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，如GABA自身和甘氨酸(glycine)的釋放(楊鯤等，待發(fā)表資料)。而抑制性遞質(zhì)釋放的減少被認為對突觸后神經(jīng)元有間接的興奮作用，因而周邊GABA對SDCN信息傳遞調(diào)節(jié)的具體機制，對信息加工的“凈作用”(net effect)，尚需進一步研究確認。

脊髓作為傷害性信息傳遞與調(diào)控的第一站，有許多位點和可作為鎮(zhèn)痛藥的靶位。最近的研究表明，蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)參與脊髓水平炎性疼痛的表達［14］。因而，影響PKC的藥物，可能有潛在的藥理學價值。N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體NR2B亞型也有類似的作用［15］。長期以來，GABAB受體作為新型藥物開發(fā)的熱點，主要集中在如何開發(fā)其配體(激動劑及變構(gòu)體)［2-3］。本研究觀察到，內(nèi)源性周邊GABA作用于谷氨酸能突觸上的GABAB受體，且只參與動作電位(突觸前刺激)引起谷氨酸釋放調(diào)節(jié)，對開發(fā)新型鎮(zhèn)痛藥物將有重要的參考價值。

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