胡黃連素硝酮對大鼠急性肺損傷的保護作用及機制研究

萬賽男，江曉間，盧肖宇，蔣 杰，王玉強，于 沛，任俊蘭，徐立朋

(1.暨南大學藥學院新藥研究所，廣東廣州 510632;2.廣東華南新藥創(chuàng)制中心，廣東廣州 510663)

胡黃連素(apocynin，Apo)，又稱夾竹桃素，是傳統(tǒng)中藥胡黃連的主要藥用成分，常用于治療糖尿病、高血壓、呼吸系統(tǒng)疾?。?-3］。急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是呼吸系統(tǒng)疾病中常見的疾病之一，肺內(nèi)聚集的大量中性粒細胞被激活，經(jīng)“呼吸爆發(fā)”產(chǎn)生大量氧自由基和活性氧引起的氧化應(yīng)激狀態(tài)，被認為在ALI的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用［4］。Apo作為一種抗氧化劑可以清除自由基，重建體內(nèi)氧化和抗氧化的平衡，起到治療ALI的作用。已有研究表明［5］，胡黃連素主要是通過抑制NADPH氧化酶活性來發(fā)揮藥理作用。Apo通過下調(diào)NADPH氧化酶亞基表達，從而抑制ROS的產(chǎn)生，達到減少超氧陰離子對肺組織損傷的目的。有文獻報道［3］NADPH氧化酶在高氧所致的急性肺損傷中起著關(guān)鍵作用。另外也有研究證明［6］Apo能夠抑制中性粒細胞NADPH氧化酶的活性，防止ROS的產(chǎn)生，對肺缺血/再灌注損傷有一定的保護作用。

近期研究表明Apo在心腦血管系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)系統(tǒng)疾病、軟骨組織病變和癌癥等方面有潛在的治療作用，關(guān)于Apo的結(jié)構(gòu)修飾研究和結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系研究卻鮮有報道。選擇目前已知有效的ROS清除劑，作為輔助官能團與Apo形成軛合物，我們合成了胡黃連素新型硝酮類衍生物，深入研究AN-1在抗氧化損傷等方面是否比原化合物具有更好的效果。本研究通過觀察胡黃連素及其硝酮衍生物對叔丁基過氧化氫誘導小鼠巨噬細胞RAW 264.7損傷的保護作用、細胞內(nèi)ROS的變化和NADPH氧化酶亞基 gp91phox表達的影響，以及在治療LPS誘導大鼠肺損傷模型中的作用來闡明其抗氧化作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株 RAW 264.7細胞株購于中山大學細胞庫。

1.1.2動物 SPF級♂SD大鼠，40只，體質(zhì)量(200±20)g，購自廣東省動物中心。

1.1.3藥品和試劑 胡黃連素，純度≥98%，購自浙江省臺州市東東醫(yī)藥化工有限公司，胡黃連素硝酮衍生物，由本研究所合成，經(jīng)HPLC檢測，純度≥98%;用DMSO溶解受試藥物，加無血清培養(yǎng)基配制，0.22 μm濾器過濾除菌，使用時用無血清培養(yǎng)基稀釋至應(yīng)用濃度(DMSO終濃度≤1%);RIPA裂解液，PMSF，BCA蛋白定量試劑盒，總SOD活性檢測試劑盒，DCFH-DA活性氧試劑盒購自江蘇海門碧云天生物技術(shù)研究所;LPS(Escherichiacoli0111:B4)購自美國Sigma公司;Purified Mouse Anti-gp91phox購自美國BD Biosciences公司，Actin鼠單克隆抗體購自美國 NeoMarkers公司;PVDF膜購自 PALL公司;ECL發(fā)光試劑盒購自美國Pierce公司。

1.1.4主要儀器設(shè)備 CO2培養(yǎng)箱(REVCO，USA);酶標儀(Bio-RAD680，USA);激光共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss 510 META DUO SCAN，Germany);美國伯樂迷你型電泳槽和轉(zhuǎn)膜槽。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng) RAW 264.7細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清且含有青霉素1×105U·L-1和鏈霉素100 mg·L-1的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞生長至對數(shù)生長期用0.25%胰酶消化。

1.2.2動物分組及模型制備 實驗動物適應(yīng)環(huán)境后，分別于 d 1和 d 16，氣管內(nèi)滴注 LPS(1 mg·kg-1)建立大鼠急性肺損傷模型，假手術(shù)(Sham)組滴注等量生理鹽水，將所有大鼠分為4組:假手術(shù)組、LPS組、Apo(3 mg·kg-1)+LPS組及 AN-1(5 mg·kg-1)+LPS組。于d 2～15，Sham組與LPS組大鼠分別灌胃1 ml的生理鹽水。在Apo(3 mg·kg-1)+LPS組，灌胃等體積Apo(3 mg·kg-1);AN-1(5 mg·kg-1)+LPS組，灌胃等體積AN-1(5 mg·kg-1)。所有的實驗指標測定均在d 17進行［9］。

1.2.3MTT法檢測AN-1對t-BHP誘導RAW 264.7細胞損傷的保護作用 取對數(shù)生長期的RAW 264.7制備成細胞懸液，以1×104個/100 μl的密度接種于96孔板中，生長24 h后，除正常組(Control)和模型組(t-BHP)外，分別用不同濃度Apo(0.1、1 和 10 μmol·L-1)、AN-1(0.1、1 和 10 μmol·L-1)預(yù)處理1 h后，除正常組其余組加入200 μmol·L-1t-BHP誘導24 h，之后每孔加入終濃度為0.5 g·L-1的MTT溶液孵育4 h，加入150 μl DMSO待紫色結(jié)晶充分溶解，用酶標儀在570 nm吸收光波長處檢測吸光度值，分析各組細胞生長的情況。細胞相對存活率/%=(實驗組吸光度值/正常組吸光度值)×100%。

1.2.4DCFH-DA熒光探針測定細胞內(nèi)ROS的變化 細胞接種于共聚焦平皿，生長24 h后，除正常組(Control)和模型組(t-BHP)外，分別用不同濃度Apo(0.1、1 和 10 μmol·L-1)、AN-1(0.1、1 和 10 μmol·L-1)預(yù)處理1 h后，除正常組其余組加入200 μmol·L-1t-BHP誘導24 h，采用對活性氧敏感的熒光探針2'，7'-二氫二氯熒光素(DCFH-DA，終濃度為20 μmol·L-1)標記細胞，37℃ 孵育 30 min，PBS洗3遍去除背景，立即用激光共聚焦顯微鏡進行掃描分析測定，檢測選用的激發(fā)波波長為488 nm，發(fā)射光波長為525 nm，于40倍鏡觀察，利用含有圖像處理系統(tǒng)和自動攝像的裝置選取不同視野拍攝圖像，所有掃描圖像存入計算機硬盤以便分析備用。

1.2.5Western blot法檢測胡黃連素衍生物對NADPH氧化酶亞基gp91phox表達的影響 細胞接種于直徑為6 cm的培養(yǎng)皿，生長24 h后，除正常組(Control)和 模型組(t-BHP)外，分別用不同濃度Apo(0.1、1 和 10 μmol·L-1)、AN-1(0.1、1 和 10 μmol·L-1)預(yù)處理1 h，除正常組其余組加入200 μmol·L-1t-BHP誘導24 h，用預(yù)冷的PBS洗3遍，加入含有1 μmol·L-1PMSF的RIPA細胞裂解液，冰上裂解 10 min，10 000 ×g、4℃離心 10 min，取上清，BCA法蛋白定量，加入含溴酚藍的上樣緩沖液100℃變性，即收獲總蛋白。按30 μg蛋白每孔上樣。配制SDS-PAGE膠:5%濃縮膠，12%分離膠。電泳:濃縮膠80 V，分離膠100 V，當溴酚藍達分離膠底部，停止電泳。濕法轉(zhuǎn)膜:恒流100 mA 60 min。5%的牛奶TBST室溫封閉1 h，加鼠來源抗gp91phox以及β-actin一抗(1∶2 000)4℃孵育過夜，TBST洗PVDF膜5遍，山羊抗鼠二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，TBST洗PVDF膜5遍，加ECL發(fā)光液，暗室顯影。用凝膠圖像分析軟件Image J對gp91phox蛋白表達進行相對定量分析，以gp91phox條帶的積分光密度與βactin的比值代表gp91phox的相對表達量。

1.2.6病理學觀察 大鼠麻醉后，放血處死動物，取出右肺下葉放入4%甲醛中固定，固定后進行脫水、透明與包埋后石蠟切片，HE染色，觀察肺組織病理學改變。

1.2.7肺組織SOD活性測定 采用黃嘌呤氧化酶法測定肺組織SOD活性。操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3 統(tǒng)計學分析實驗結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示，統(tǒng)計學分析采用SPSS 17.0軟件處理系統(tǒng)進行，均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)方法中的LSD檢驗，組間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1AN-1對t-BHP誘導RAW 264.7細胞損傷的保護作用濃度為200 μmol·L-1的t-BHP可以明顯損傷 RAW 264.7細胞，Apo和 AN-1 0.1，1，10 μmol·L-1預(yù)處理1 h后對RAW 264.7細胞損傷顯示不同程度保護作用。如Fig 1所示，與t-BHP組相比，Apo在 10 μmol·L-1起保護作用，而 AN-1 在 1和 10 μmol·L-1時都起保護作用(P＜0.05)，且在10 μmol·L-1時作用明顯，表明胡黃連素經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾后對細胞的保護作用更強。

Fig 1 Protective effect against t-BHP induced damages in RAW 264.7 cells(xˉ±s，n=3)

2.2AN-1降低RAW 264.7細胞內(nèi)ROS水平叔丁基過氧化氫處理RAW 264.7后，細胞內(nèi)活性氧水平明顯升高，熒光強度明顯增加。如Fig 2所示，經(jīng)Apo和AN-1預(yù)處理1 h后均可抑制細胞內(nèi)活性氧的形成，但是Apo清除自由基效果不明顯，隨著AN-1濃度的增加，細胞內(nèi)綠色熒光強度呈劑量依賴性減弱，在高濃度10 μmol·L-1時作用效果最為明顯。

2.3AN-1可抑制t-BHP誘導RAW 264.7細胞NADPH氧化酶亞基gp91phox活性的升高叔丁基過氧化氫處理 RAW 264.7細胞后，可激活細胞內(nèi)NADPH氧化酶亞基gp91phox，表達量近為正常組兩倍(P＜0.01)，經(jīng)AN-1和Apo預(yù)處理細胞后，可以明顯降低RAW 264.7內(nèi)NADPH氧化酶亞基gp91phox表達，僅在 0.1 μmol·L-1時，AN-1 就可以達到降低gp91phox表達的目的(P＜0.05)，在1 μmol·L-1或 10 μmol·L-1時，AN-1 和 Apo 均可抑制t-BHP誘導RAW 264.7細胞的gp91phox表達量的升高(P＜0.01)，結(jié)果見 Fig 3。

2.4AN-1對LPS誘導大鼠急性肺損傷的保護作用從肺大體觀可以看出LPS可引起嚴重的肺腫大，而AN-1治療組和Apo治療組均能改善LPS介導的肺腫大現(xiàn)象，肺體積大小與空白組相當，明顯小于模型組(數(shù)據(jù)未列出)。病理切片結(jié)果Fig 4顯示與Sham組比較LPS導致組肺組織明顯受損，肺泡間隔增寬，肺泡完整性被破壞，AN-1治療組的肺泡及肺泡囊結(jié)構(gòu)恢復正常，肺泡間僅見少量炎性細胞浸潤，Apo治療組的炎癥現(xiàn)象也得到改善。結(jié)果表明，AN-1比Apo具有更好的治療急性肺損傷的作用。

Fig 2 ROS-scavenging effect in RAW 264.7 cells(×400)

Fig 3 Effects of Apo and AN-1 on gp91phox expression in RAW 264.7 cells(ˉx ± s，n=3)

Fig 4 Protective effect in LPS-induced lung damage in rats by Apo and AN-1(HE，×50)

2.5AN-1對肺組織中SOD活性的影響實驗結(jié)果(Fig 5)顯示，LPS組的肺組織SOD活性較Sham組明顯降低(P＜0.01)。與LPS組比較，Apo+LPS組能改善肺組織中SOD的活性(P＜0.05)，而AN-1+LPS組可提高SOD活性(P＜0.01)。

3 討論

急性肺損傷是最常見的呼吸系統(tǒng)急癥之一，NADPH氧化酶介導的超氧陰離子產(chǎn)生在其發(fā)病過程中起著重要作用。LPS攻擊動物肺部后，肺組織丙二醛(MDA)含量增加、SOD和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性降低，大量炎癥因子產(chǎn)生，可以造成肺泡毛細血管膜損導致多形核中性粒細胞的附著、激活與積壓，同時影響氣體交換并最終導致呼吸衰竭［7-8］。

Fig 5 AN-1 attenuated the decreased SOD activity in lungs by the administration of LPS(±s，n=8)

研究報道顯示［9］Apo對LPS誘導“兩次打擊”肺損傷的大鼠具有明顯的保護作用，可以提高大鼠的存活率，降低血清和肺組織中MDA含量，下調(diào)髓過氧化物酶活性。此外也有研究表明，LPS可以上調(diào)豬肺動脈平滑肌細胞NADPH氧化酶亞基gp91phox表達、活性氧和炎癥因子的產(chǎn)生，而胡黃連素作為NADPH氧化酶抑制劑，可以降低LPS誘導豬肺動脈平滑肌細胞的ROS含量，抑制炎癥因子的產(chǎn)生［10］。本研究所發(fā)現(xiàn)［11］硝酮衍生物，如川芎嗪的硝酮衍生物TBN可明顯保護過氧化氫誘導的神經(jīng)細胞損傷。基于硝酮結(jié)構(gòu)化合物的抗氧化活性，合成了胡黃連素的硝酮衍生物AN-1，實驗證明AN-1對t-BHP誘導的RAW 264.7細胞損傷模型中有明顯的細胞保護作用，與t-BHP 組相比，Apo 在 10 μmol·L-1起保護作用，而AN-1在1和10 μmol·L-1時都起保護作用(P＜0.05)，且在 10 μmol·L-1時作用更加明顯，表明胡黃連素經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾后對細胞的保護作用更強。為了進一步研究AN-1是否通過抑制NADPH氧化酶活性來發(fā)揮保護細胞損傷的作用，我們進行了細胞內(nèi)活性氧檢測和NADPH氧化酶亞基gp91phox表達量的測定，激光共聚焦結(jié)果顯示AN-1清除細胞內(nèi)ROS的作用比Apo更明顯;免疫印記結(jié)果表明AN-1仍然是有效的NADPH氧化酶抑制劑?；谇懊娴难芯?，為了進一步證明AN-1在動物體內(nèi)的治療效果，我們進行了AN-1對LPS誘導的急性肺損傷大鼠模型的保護作用研究，病理結(jié)果顯示LPS組大鼠肺組織肺泡腔塌陷，肺泡隔明顯增寬，見大量炎癥細胞浸潤;肺間質(zhì)水腫，血管管壁增厚。給予Apo治療后大鼠肺損傷較LPS組明顯減輕，而給予AN-1治療后，可以有效減輕水腫和出血，肺泡間隔趨于正常組，并且AN-1可以明顯提高LPS誘導的急性肺損傷大鼠肺組織的SOD活性，結(jié)果表明AN-1治療效果優(yōu)于Apo。

綜上所述，胡黃連素的硝酮衍生物通過下調(diào)NADPH氧化酶亞基gp91phox表達，抑制NADPH氧化酶劑的活性，從而可以達到清除細胞內(nèi)氧自由基，保護細胞免受自由基損傷的目的。在治療LPS誘導急性肺損傷模型中的優(yōu)勢也證明胡黃連素的硝酮衍生物是一個新型有效的自由基清除劑。

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