N-乙酰半胱氨酸影響p38有絲分裂原活化蛋白激酶對(duì)順鉑誘導(dǎo)急性腎損傷的保護(hù)作用

羅景慧，楊迎暴，安田日出夫，菱田明

(1.南方醫(yī)院藥學(xué)部，廣東廣州 510515;2.南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院臨床藥理學(xué)系，廣東廣州 510515;3.浜松醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院第一內(nèi)科，日本浜松 431-3192)

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是由某種原因引起腎小球?yàn)V過(guò)率急劇持續(xù)下降，導(dǎo)致機(jī)體代謝產(chǎn)物在血液蓄積的一種臨床綜合征，病死率高達(dá)65%［1-2］，是臨床內(nèi)科常見(jiàn)的嚴(yán)重急癥，及時(shí)消除誘發(fā)因素、早期采取防治措施，對(duì)于改善AKI預(yù)后、挽救患者生命具有重要意義。在重癥AKI患者中，超過(guò)20%為藥物性腎損害［3］，隨著近年來(lái)醫(yī)藥工業(yè)的迅猛發(fā)展，新藥不斷在臨床應(yīng)用，藥物誘導(dǎo)AKI呈逐年增加趨勢(shì)，已成為臨床醫(yī)藥工作者不可回避的問(wèn)題。

藥源性AKI發(fā)生的病理生理學(xué)機(jī)制尚未完全闡明。研究表明，有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)家 族 成 員p38MAPK激活與順鉑(CDDP)、慶大霉素等多種腎臟毒性藥物以及缺血/再灌注損傷所引起AKI關(guān)系密切［4-7］，同時(shí)，抑制p38MAPK能夠明顯降低藥物對(duì)腎小管細(xì)胞的毒性作用［8］，提示p38MAPK信號(hào)通路可能是藥物性AKI和防治藥物性AKI的重要途徑。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)是一種用于呼吸道感染的療效良好而且安全的祛痰藥。近年研究表明，NAC作為巰基供體，具有強(qiáng)抗氧化作用，對(duì)肝臟損傷、腎臟損傷、心肌損傷、肺臟損傷、胃腸損傷、聽(tīng)力損傷、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷具有保護(hù)作用［9-13］。但是，NAC對(duì)藥物性腎損傷的影響和機(jī)制尚缺乏研究，本文擬采用CDDP誘導(dǎo)大鼠AKI模型，研究NAC對(duì)p38MAPK的影響及其下游凋亡因子的關(guān)系，探導(dǎo)NAC對(duì)CDDP誘導(dǎo)AKI的拮抗作用，為臨床尋找有效對(duì)抗藥物提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試劑與藥品NAC、SB203580購(gòu)自Sigma(St.Louis，MO，USA)。CDDP 購(gòu)自 Nippon Kayaku(Tokyo，Japan)。腎臟組織 caspase-3測(cè)定試劑盒購(gòu)自Roche(Indianapolis，USA)。TUNEL試劑盒購(gòu)于Oncor(Gaithersburg，MD，USA)。蛋白抑制劑 cocktail購(gòu)自 Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)，磷酸酶抑制劑 cocktail購(gòu)自 Roche(Indianapolis，USA)，兔抗caspase-3、Bcl-2、Bax、p38MAPK 購(gòu) 于 Santa Cruz(Santa Cruz，CA，USA)，HRP-IgG 二抗購(gòu)自 Pierce(Rockford，IL，USA)。其它試劑均為分析純。

1.2動(dòng)物健康♂ SD大鼠，體質(zhì)量200～250 g，SPF級(jí)，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)為SCXK粵2006-0015號(hào)。

1.3動(dòng)物分組與實(shí)驗(yàn)方案大鼠48只，隨機(jī)分為6組，每組8只，包括正常對(duì)照組、CDDP誘導(dǎo)AKI模型對(duì)照組、NAC 50 mg·kg-1+CDDP組，NAC 100 mg·kg-1+CDDP組，NAC 200 mg·kg-1+CDDP組，p38MAPK特異性抑制藥SB203580 10 mg·kg-1+CDDP組。NAC組和SB203580組每日腹腔注射給藥1次，連續(xù)3 d后，CDDP模型對(duì)照組、NAC組與SB203580組均靜脈注射CDDP(5 mg·kg-1)1次，隨后繼續(xù)給予NAC與SB203580，連續(xù)5日。正常對(duì)照組腹腔注射給予空白溶劑，每日1次。

1.4樣品取得與處理于最后一次給藥后24 h，乙醚麻醉，打開(kāi)腹腔，暴露腹主動(dòng)脈，以頭皮針插管，以冰PBS由腹主動(dòng)脈灌流后，迅速取出雙腎，去除被膜，冰PBS漂洗干凈。腎臟組織橫切成片狀分成3份，第1部分快速以液氮凍存，-80℃冰箱保存供Western blot測(cè)定 caspase-3、Bcl-2、Bax、p38MAPK 水平;第2部分以5%福爾馬林液固定過(guò)夜，TUNEL法進(jìn)行凋亡細(xì)胞觀察;第3部分組織供勻漿測(cè)定caspase-3水平。

1.5TUNEL法檢測(cè)腎臟組織凋亡情況TUNEL法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。簡(jiǎn)言之，石蠟包埋，切片，常規(guī)脫蠟脫水，用新鮮配制的體積分?jǐn)?shù)為0.03 H2O2處理，蒸餾水洗滌。加入以Tris緩沖液配制的蛋白酶K(1∶100)、37℃孵育10 min，加入含 TdT、DIG-dUTP 的標(biāo)記緩沖液 20 μl，37℃ 孵育 2 h，Tris緩沖液洗滌，加封閉液50 μl，甩干，加入抗DIG生物素(1 ∶100)50 μl，37 ℃孵育30 min 后，以3，3-二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(DAB)顯色20 min，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封固，顯微鏡下胞質(zhì)或胞核中有棕色顆粒者為陽(yáng)性凋亡細(xì)胞。每組8只大鼠各取1張切片，每張切片采集8個(gè)連續(xù)不重疊視野(400×)，對(duì)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，以凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比作為腎臟組織細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)。

1.6Elisa法測(cè)定caspase-3水平取200 mg腎臟組織制備的勻漿樣本，按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定腎組織caspase-3水平。簡(jiǎn)言之，取勻漿樣本和不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品加入板條中孵育，再依次加入生物素化抗體工作液、酶結(jié)合物工作液及顯色劑孵育(100 μl/孔)，最后加入終止液(100 μl/孔)，混勻后5 min內(nèi)酶標(biāo)儀上450 nm處測(cè)定OD值。

1.7Western blot檢測(cè)caspase-3、Bcl-2、Bax、p38MAPK表達(dá)水平取腎臟組織100 mg在冰凍下研成粉末，以1 ml緩沖液［0.01(V/V)NP-40，0.001(W/V)SDS，0.005(W/V)脫氧膽酸鈉，150 mmol·L-1NaCl和 20 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0］勻漿，其中含苯甲磺酰氟(PMSF，1 μmol·L-1)、蛋白抑制劑cocktail和磷酸酶抑制劑cocktail，勻漿液在4℃以15 000×g離心20 min，上清液即為蛋白提取液，F(xiàn)olin-酚進(jìn)行蛋白定量，取相當(dāng)于15 μg蛋白量的蛋白提取液樣本上樣，然后按常規(guī)進(jìn)行SDSPAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，以含5%脫脂奶粉的 TBS室溫下封閉2 h，在膜上加入兔抗caspase-3、Bcl-2、Bax、p38MAPK(1 ∶500)，4 ℃下孵育過(guò)夜。棄一抗，以TBS洗滌3次，每次10 min。加入TBS稀釋的HRP-IgG二抗中(1∶5 000)，室溫孵育2 h。棄二抗，以TBS洗滌3次，每次10 min，加入ECL發(fā)光劑，室溫下孵育5 min后用X線感光膠片曝光，顯影和定影。用凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)caspase-3、Bcl-2、Bax、p38MAPK 蛋白條帶與相應(yīng)的內(nèi)參照β-actin條帶進(jìn)行灰度掃描，以?xún)烧邟呙鑿?qiáng)度比值作為蛋白表達(dá)的相對(duì)表達(dá)量。

1.8數(shù)據(jù)處理結(jié)果均以±s表示，采用SPSS 13.0進(jìn)行組間數(shù)據(jù)比較。

2 結(jié)果

2.1NAC對(duì)CDDP誘導(dǎo)AKI大鼠腎臟pp38MAPK水平的影響與正常對(duì)照組相比，CDDP誘導(dǎo)AKI模型組p-p38MAPK水平升高(P＜0.01);給予 NAC和 SB203580后，與模型組相比，pp38MAPK水平降低(P＜0.01)，且具有劑量依賴(lài)性(Fig 1)。

Fig 1 Effect of NAC on p-p38MAPK in kidney of CDDP-induced AKI rats(±s，n=8)

2.2NAC對(duì)CDDP誘導(dǎo)AKI大鼠腎臟組織細(xì)胞凋亡的影響(Fig 2A～F)可見(jiàn)，凋亡細(xì)胞以核內(nèi)染色質(zhì)明顯濃縮聚集、呈棕黃色顆粒為特征。正常對(duì)照組很少見(jiàn)凋亡細(xì)胞，CDDP誘導(dǎo)AKI大鼠模型組可見(jiàn)大量凋亡細(xì)胞，凋亡指數(shù)升高，與正常對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，NAC組和SB203580組凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少，凋亡指數(shù)下降，與CDDP模型對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，NAC 100 mg·kg-1和 200 mg·kg-1組與SB203580組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Tab 2)。

Fig 2 Effect of NAC on apoptosis in kidney of CDDP-induced AKI rats(400×)

Tab 2 Effect of NAC on apoptosis in kidney of CDDP-inducd AKI rats(±s，n=8)

Tab 2 Effect of NAC on apoptosis in kidney of CDDP-inducd AKI rats(±s，n=8)

▲▲P ＜0.01 vs control;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs CDDP

Group Dose/mg·kg-1TUNEL/positive cells AI/%Control - 16±3 1.85±0.41 CDDP - 245±28▲▲ 27.45±6.22▲▲NAC 50 194±19* 22.18±3.82*100 142±21＊＊ 15.78±3.16＊＊200 149±15＊＊ 15.49±4.04＊＊SB203580 10 138±12＊＊ 14.97±3.26＊＊

2.3NAC對(duì)CDDP誘導(dǎo)AKI大鼠腎臟caspase-3水平的影響與正常對(duì)照組相比，CDDP誘導(dǎo)AKI模型組caspase-3水平升高(P＜0.01);與模型組相比，NAC組和SB203580組的caspase-3水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，NAC 100 mg·kg-1和200 mg·kg-1組與SB203580組caspase-3水平相似(Fig 3A～B)。

Fig 3 Effect of NAC on caspase-3 in kidney of CDDP-induced AKI rats(±s，n=8)

2.4NAC對(duì)CDDP誘導(dǎo)AKI大鼠腎臟Bax、Bcl-2水平的影響與正常對(duì)照組相比，CDDP誘導(dǎo)AKI模型組Bax水平升高、Bcl-2水平降低(P＜0.01);與模型組相比，NAC組和SB203580組Bax水平降低、Bcl-2水平升高(P＜0.01，F(xiàn)ig 4)。

3 討論

CDDP是臨床最常用廣譜抗癌藥物之一，但是，由于具有劑量依賴(lài)性急性腎臟毒性作用，極大限制其臨床應(yīng)用。雖然CDDP引起腎臟毒性早已明確，但是，其病理生理學(xué)機(jī)制尚有待進(jìn)一步闡明。研究發(fā)現(xiàn)，氧化性損傷可能是CDDP引起腎功能損傷的主要原因［14-15］，而氧化應(yīng)激反應(yīng)及在氧化過(guò)程中產(chǎn)生的多種代謝產(chǎn)物，一方面直接損傷細(xì)胞核酸、蛋白質(zhì)、粘多糖和脂類(lèi)物質(zhì)，另一方面通過(guò)多種途徑激活細(xì)胞內(nèi)凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，引起組織細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致有功能的腎小管細(xì)胞、腎小球和腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞損害和壞死，產(chǎn)生腎功能短時(shí)間內(nèi)急劇衰退，表現(xiàn)急性腎功能損害［16］。本研究表明，CDDP誘導(dǎo)腎臟組織發(fā)生明顯的細(xì)胞凋亡，可能是CDDP對(duì)腎臟形態(tài)學(xué)和機(jī)能學(xué)損害的主要原因之一，NAC可以明顯減輕CDDP所引起的凋亡事件，從而保護(hù)腎臟組織形態(tài)學(xué)完整性和維持機(jī)能正常。

Fig 4 Effects of NAC on Bax and Bcl-2 in kidney of CDDP-induced AKI rats(±s，n=8)

近年研究表明，MAPK成員p38MAPK是介導(dǎo)氧化應(yīng)激和多種細(xì)胞因子產(chǎn)生細(xì)胞凋亡、分化及炎癥反應(yīng)的重要細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，與CDDP、慶大霉素等腎臟毒性藥物以及缺血/再灌注所引起腎損傷關(guān)系密切［4-7］。體外實(shí)驗(yàn)表明，p38MAPK抑制劑能夠降低CDDP對(duì)腎小管細(xì)胞的細(xì)胞毒性［8］，提示p38MAPK信號(hào)通路可能是CDDP導(dǎo)致腎臟損傷的重要途徑。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CDDP誘導(dǎo)產(chǎn)生AKI，可以使p-p38MAPK升高;NAC則與p38MAPK抑制藥相似，對(duì)p38MAPK的表達(dá)具有抑制作用，提示CDDP的腎臟毒性與MAPK途徑有關(guān)。

另一方面，作為p38MAPK的下游信號(hào)，caspase是p38MAPK實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)凋亡的重要細(xì)胞因子，其中活化型caspase-3是caspase家族實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的終末因子［17］。同時(shí)，p38MAPK還可激活促凋亡蛋白Bax，可使線粒體外膜通透性增強(qiáng)，釋放位于膜間隙作為下游凋亡級(jí)聯(lián)信號(hào)啟動(dòng)因子的細(xì)胞色素C，而抑制抗凋亡蛋白Bcl-2，進(jìn)一步損傷維持線粒體膜的穩(wěn)定性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而 NAC可通過(guò)p38MAPK通路影響caspase、Bax等表達(dá)而抑制凋亡過(guò)程［18］。由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，CDDP誘導(dǎo)產(chǎn)生AKI，可以使caspase-3、Bax升高，而 Bcl-2降低;NAC則與p38MAPK抑制藥相似，使caspase-3、Bax水平降低，提示CDDP的腎臟毒性通過(guò)p38MAPK途徑調(diào)控的凋亡。

綜上所述，CDDP誘導(dǎo)產(chǎn)生 AKI時(shí)，可以使p38MAPK激活，并增強(qiáng)下游與凋亡相關(guān)的細(xì)胞因子表達(dá)水平，而NAC抑制p38MAPK激活，減少下游與凋亡相關(guān)的細(xì)胞因子表達(dá)水平，提示NAC通過(guò)影響p38MAPK而拮抗CDDP的腎臟毒性作用，這為臨床探索解決藥物性腎臟損害的課題提供了理論依據(jù)。

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