阿司匹林對(duì)環(huán)磷酰胺大鼠皮質(zhì)骨的影響

于 瓊，吳 鐵，崔 燎，2

(1.廣東醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣東東莞 523808;2.廣東天然藥物研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江 524023)

環(huán)磷酰胺(cyclophsphamide，CP)作為抗腫瘤和免疫抑制劑已在臨床廣泛應(yīng)用，療效確切，但也伴隨多臟器毒性，曾被報(bào)道能使人的骨密度迅速減少，繼而出現(xiàn)骨質(zhì)疏松［1］。本項(xiàng)目組曾用環(huán)磷酰胺分別建立了大鼠和小鼠低轉(zhuǎn)換型的骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型［2-3］，探討環(huán)磷酰胺對(duì)骨的影響，并試圖通過(guò)該模型來(lái)篩選能促進(jìn)骨形成，防治老年性骨質(zhì)疏松的藥物。阿司匹林(aspirin，AS)作為百年老藥，有著極其神奇的一面，它能參與多種生理活動(dòng)，又可在不同劑量下表現(xiàn)出不同的作用機(jī)制。Carbone等［4］的調(diào)查表明，服用阿司匹林的人往往具有著更高的骨密度。給予糖尿病大鼠100 mg·d-1的阿司匹林可有效提高其腰椎骨的骨密度和骨質(zhì)量［5］;早在1991年就曾報(bào)道阿司匹林可影響正常大鼠的骨再建過(guò)程，而且存在明顯的劑量依賴(lài)性［6］，但該研究?jī)H停留在了大劑量上，其結(jié)果表現(xiàn)出骨代謝抑制作用［7］，而對(duì)中、低劑量卻未能涉及。本實(shí)驗(yàn)用環(huán)磷酰胺作為工具藥物造成大鼠的骨質(zhì)疏松模型，通過(guò)骨形態(tài)計(jì)量學(xué)，骨生物力學(xué)，骨有機(jī)質(zhì)成分檢測(cè)等方法來(lái)觀察中、低劑量的阿司匹林對(duì)大鼠脛骨中段骨和股骨等皮質(zhì)骨材料的作用效果，并與陽(yáng)性對(duì)照藥物碳酸鈣維D進(jìn)行比較，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑

1.1.1藥品 阿司匹林(藥用原料藥):由山東新華制藥股份有限公司提供，使用時(shí)用少量乙醇促溶后用生理鹽水調(diào)整到實(shí)驗(yàn)室所需濃度。中劑量是根據(jù)體表面積法由正常成人500 mg日用量換算而來(lái)，稀釋5倍為低劑量。環(huán)磷酰胺:江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào):403501。碳酸鈣維D片:美國(guó)安士制藥公司，批號(hào):5B16656，每片相當(dāng)于鈣300 mg，Vit D 100單位。

1.1.2試劑 鹽酸四環(huán)素:上海新亞制藥廠生產(chǎn)，批號(hào):891224-18;甲基丙烯酸甲酯:北京化工廠生產(chǎn)，批號(hào):940117;Calcein(Sigma chemical Co.USA，lot:61F0527);羥脯氨酸試劑盒(堿水解法，南京建成生物技術(shù)有限公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器低速鋸(Buehler LTD USA)，Leica組織切片機(jī)(德國(guó))，LEICA QWN半自動(dòng)圖像分析儀(德國(guó)萊卡)，電感偶合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP，美國(guó)TJA公司)，UV-752紫外分光光度計(jì)(上海第三醫(yī)學(xué)儀器廠)，858 Mini Bionix型材料測(cè)試系統(tǒng)(MTS，美國(guó))。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 3月齡的SD大鼠，50只，♀♂各半，體質(zhì)量(208±28)g，由廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，SPF級(jí)，動(dòng)物合格證號(hào):2005A023。按體重對(duì)等原則隨即分成5組，每組10只。正常對(duì)照組(NS組):該組大鼠每天灌胃給予5 ml·kg-1·d-1生理鹽水。環(huán)磷酰胺模型組(CP組)，該組大鼠每天灌胃給予環(huán)磷酰胺4.5 mg·kg-1·d-1。陽(yáng)性藥物對(duì)照組(CS組)，該組大鼠每天灌胃給予環(huán)磷酰胺4.5 mg·kg-1·d-1及碳酸鈣維D 0.4 mg·kg-1·d-1。中劑量阿司匹林組(DAS組):該組大鼠每天灌胃給予環(huán)磷酰胺4.5 mg·kg-1·d-1及阿司匹林45 mg·kg-1·d-1。低劑量阿司匹林組(LAS組):該組大鼠每天灌胃給予環(huán)磷酰胺4.5mg·kg-1·d-1及阿司匹林9 mg·kg-1·d-1。5 組動(dòng)物均自由飲水和進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飼料。共給藥15 d，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取左側(cè)脛骨中段骨浸泡于4%的甲醛中24 h，按不脫鈣法包埋、磨片后進(jìn)行骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)測(cè)量;取右側(cè)股骨生理鹽水紗布，錫紙包裹，-20℃保存，待骨生物力學(xué)檢測(cè)及骨有機(jī)質(zhì)和礦物含量檢測(cè)。

1.3.2骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)測(cè)量［8］依方法在骨組織形成雙熒光標(biāo)記，不脫鈣法包埋、磨片，進(jìn)行骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)測(cè)量。骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)靜態(tài)參數(shù)包括:皮質(zhì)面積(Ct.Ar)，皮質(zhì)面積百分率(%Ct.Ar)，骨髓面積百分率(%Ma.Ar);動(dòng)態(tài)參數(shù)包括骨外膜標(biāo)記周長(zhǎng)百分率(%P-L.Pm)，骨外膜骨礦化沉積率(P-MAR)，骨外膜骨形成率(P-BFR/BS)，骨內(nèi)膜標(biāo)記周長(zhǎng)百分率(%E-L.Pm)，骨內(nèi)膜骨礦化沉積率(E-MAR)，骨內(nèi)膜骨形成率(E-BFR/BS)。

1.3.3骨生物力學(xué)檢測(cè)［9］檢測(cè)時(shí)，將-20℃保存的骨材料常溫解凍，生理鹽水復(fù)濕。用858 Mini Bionix型材料測(cè)試系統(tǒng)監(jiān)測(cè)和分析大鼠右側(cè)股骨的生物力學(xué)性能。將股骨置于流變儀上分別進(jìn)行三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)，加載速度為0.01 mm·s-1，跨距為15 mm。記錄載荷-變形曲線，從曲線上直接獲取或依公式計(jì)算出相應(yīng)的力學(xué)指標(biāo):彈性載荷(使骨骼發(fā)生彎曲變形時(shí)所加載的外力);最大載荷(骨骼發(fā)生骨折所承受的最大外力);剛性系數(shù)(骨硬度指標(biāo)，反映抗變形的能力);韌性系數(shù)(骨塑性指標(biāo)，反映骨的韌度);彈性模量(骨內(nèi)在硬度，與骨骼的幾何形狀和尺寸無(wú)關(guān))。

1.3.4骨基質(zhì)成分檢測(cè) 將生物力學(xué)檢測(cè)后的骨材料80℃烘干至恒重，用AE240電子天平稱(chēng)重;然后，每份骨樣本加6 mol·L-1HCl在108℃溫度下消化16 h后，把消化液分成兩份。一份稀釋后用ICP儀測(cè)定骨Ca、P的含量，與骨干重進(jìn)行比較，用骨礦物元素量(mg)/骨干重(g)的比值來(lái)作為骨礦物質(zhì)含量的指標(biāo)，骨礦物元素量/骨干重的比值越大，說(shuō)明骨礦物質(zhì)在骨中所占的比例越大。另一份消化液過(guò)濾后調(diào)pH值至6，然后，經(jīng)典法測(cè)定羥脯氨酸吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出其含量。

1.3.5數(shù)據(jù)處理參數(shù)值用±s表示，采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1阿司匹林對(duì)環(huán)磷酰胺大鼠皮質(zhì)骨骨組織形態(tài)學(xué)的影響

2.1.1阿司匹林對(duì)環(huán)磷酰胺大鼠脛骨中段骨組織形態(tài)學(xué)靜態(tài)參數(shù)的影響 與NS組相比，脛骨中段皮質(zhì)骨的骨靜態(tài)參數(shù)中%Ct.Ar(皮質(zhì)面積百分率)明顯下降(P＜0.05)，%Ma.Ar(骨髓面積百分率)明顯增加(P＜0.05)，提示環(huán)磷酰胺可致使大鼠中段骨管壁變薄，骨髓腔明顯增大，皮質(zhì)骨體積減少。而中、低劑量的阿司匹林與碳酸鈣維D均可有效的對(duì)抗環(huán)磷酰胺所造成的大鼠皮質(zhì)骨丟失，骨髓腔擴(kuò)大。各組大鼠脛骨中段骨組織形態(tài)學(xué)靜態(tài)參數(shù)的改變見(jiàn)Tab 1。

Tab 1 Effect of aspirin in the static histomorphometry paramerers of cortical bone in CP-treated rats(n=10)

2.1.2阿司匹林對(duì)環(huán)磷酰胺大鼠脛骨中段骨組織形態(tài)學(xué)動(dòng)態(tài)參數(shù)的影響 與NS組相比，CP組大鼠脛骨中段皮質(zhì)骨的骨動(dòng)態(tài)參數(shù)中P-MAR(骨外膜骨礦化沉積率)，P-BFR/BS(骨外膜骨形成率)明顯下降(P＜0.05)，而對(duì)內(nèi)膜參數(shù)沒(méi)有明顯影響;提示環(huán)磷酰胺能明顯抑制大鼠皮質(zhì)骨外膜的骨形成和礦化作用，對(duì)內(nèi)膜骨形成的影響不明顯。而中、低劑量的阿司匹林與碳酸鈣維D均可有效的對(duì)抗環(huán)磷酰胺對(duì)大鼠皮質(zhì)骨外膜的成骨抑制作用。各組大鼠脛骨中段骨組織形態(tài)學(xué)動(dòng)態(tài)參數(shù)的改變見(jiàn)Tab 2。

2.2阿司匹林對(duì)環(huán)磷酰胺大鼠股骨骨生物力學(xué)指標(biāo)的影響與NS組相比，CP組大鼠股骨骨生物力學(xué)指標(biāo)中彈性載荷、最大載荷、剛性系數(shù)等均下降(P＜0.05)，彈性模量和韌性系數(shù)無(wú)改變;提示環(huán)磷酰胺大鼠股骨韌性(韌性系數(shù))無(wú)改變，但其整體的抗變形(彈性載荷、剛性系數(shù))和抗骨折(最大載荷)的能力下降，而這種下降是與股骨的形狀、尺寸等結(jié)構(gòu)因素相關(guān)的，所以其內(nèi)在的抗變形能力(彈性模量)降低不明顯。與CP組比較，CS組的彈性載荷、最大載荷、剛性系數(shù)均有效增加(P＜0.05)，彈性模量無(wú)改變，韌性系數(shù)下降(P＜0.01);提示碳酸鈣維D可有效的增加大鼠股骨的抗變形和抗骨折能力，而這種效果是與改善股骨的形狀尺寸等結(jié)構(gòu)因素有關(guān)，但同時(shí)也會(huì)致使股骨的韌性下降。與CP組比較，MAS組的彈性載荷、剛性系數(shù)明顯增加，韌性系性系數(shù)下降(P＜0.05)，最大載荷和彈性模量有上升趨勢(shì)，但差異無(wú)顯著性;提示中劑量的阿司匹林僅能有效地增加環(huán)磷酰胺大鼠股骨的整體的抗彎曲能力，且與改善股骨的形狀尺寸等結(jié)構(gòu)因素有關(guān)，同時(shí)會(huì)使股骨的韌性減弱，而抗骨折能力沒(méi)有明顯增強(qiáng)。與CP組比較，LAS組除韌性系數(shù)外的指標(biāo)均能有效增加(P＜0.05);提示小劑量的阿司匹林同時(shí)改善環(huán)磷酰胺大鼠股骨的內(nèi)在和外在的抗彎曲能力，且韌性系數(shù)也無(wú)下降，抗骨折能力增強(qiáng)。各組大鼠股骨生物力學(xué)指標(biāo)的改變見(jiàn)Tab 3。

Tab 2 Effect of aspirin on the dynamic histomorphometry paramerers of cortical bone in CP-treated rats(n=10)

Tab 3 Effect of aspirin on biomechanics of vitodynamics in CP-treated rats(n=10)

Tab 4 Effect of aspirin on bone matrix of femur in CP-treated rats(n=10)

2.3阿司匹林對(duì)環(huán)磷酰胺大鼠股骨骨基質(zhì)成分的影響與NS組相比，CP組的Hyp、Ca2+和P3+均明顯下降(P＜0.05)，而 Ca2+/Hyp和 Ca2+/P3+沒(méi)有明顯改變;說(shuō)明環(huán)磷酰胺使大鼠股骨的有機(jī)質(zhì)和無(wú)機(jī)物以及無(wú)機(jī)物中的鈣和磷均為同比例丟失。與CP組相比，CS組、MAS組和LAS組的Hyp、Ca2+和P3+均明顯增加，Ca2+/Hyp明顯降低(P＜0.05)，Ca2+/P3+有下降趨勢(shì)，但差異無(wú)顯著性;提示碳酸鈣維D以及中、低劑量的阿司匹林均可有效地對(duì)抗環(huán)磷酰胺大鼠骨基質(zhì)的丟失，且有機(jī)質(zhì)的增加大于無(wú)機(jī)物的增加，而無(wú)機(jī)物的增加中骨磷稍多于骨鈣，但基本為同比例。各組大鼠股骨骨基質(zhì)成分的改變見(jiàn)Tab 4。

3 討論

由Tab 2的結(jié)果可知，5組大鼠皮質(zhì)骨的%E-L.Pm僅為%P-L.Pm的15%左右，且數(shù)值小，標(biāo)準(zhǔn)差大，說(shuō)明大鼠正處于成熟前的骨建造期，而內(nèi)膜的骨重建不明顯。由Tab 1和Tab 2，CP組對(duì)比NS組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，環(huán)磷酰胺抑制了大鼠皮質(zhì)骨外膜的形成礦化，使骨骼的向外生長(zhǎng)減慢，脛骨骨干變細(xì)。同時(shí)，大鼠皮質(zhì)骨內(nèi)膜的骨吸收作用仍在，脛骨骨髓腔擴(kuò)大，皮質(zhì)骨進(jìn)一步減少。骨生物力學(xué)包括結(jié)構(gòu)力學(xué)和材料力學(xué)兩種指標(biāo)，前者是評(píng)價(jià)骨骼的整體質(zhì)量，而后者則是評(píng)價(jià)骨骼的內(nèi)在質(zhì)量，排除了骨骼形狀和尺寸等因素的影響［9］。由Tab 3中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，環(huán)磷酰胺可致使大鼠的彈性載荷，最大載荷等骨結(jié)構(gòu)力學(xué)性能明顯下降，但彈性模量這材料力學(xué)指標(biāo)卻沒(méi)有明顯改變;說(shuō)明環(huán)磷酰胺造成的大鼠股骨骨質(zhì)量下降與皮質(zhì)骨的形狀尺寸有關(guān)，這個(gè)結(jié)果也與前面CP組大鼠骨組織靜態(tài)參數(shù)的結(jié)果相符。骨基質(zhì)包括膠原物質(zhì)的骨有機(jī)質(zhì)和鈣磷等礦物質(zhì)的骨無(wú)機(jī)物兩大部分。由Tab 4中CP組對(duì)比NS組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，CP組大鼠股骨的有機(jī)質(zhì)和無(wú)機(jī)物以及無(wú)機(jī)物中的鈣和磷均為同比例丟失;說(shuō)明環(huán)磷酰胺對(duì)成骨細(xì)胞分泌膠原和促進(jìn)礦化的作用均產(chǎn)生了抑制。雖然生長(zhǎng)期大鼠皮質(zhì)骨的生長(zhǎng)特點(diǎn)與老年人類(lèi)存在差別，但由上述的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)環(huán)磷酰胺大鼠皮質(zhì)骨的改變與人類(lèi)因年齡增長(zhǎng)而發(fā)生骨質(zhì)疏松的皮質(zhì)骨部分的病變特點(diǎn)一致，所以我們可以用該模型來(lái)篩選防治老年性骨質(zhì)疏松的藥物。

由CS組對(duì)比CP組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，碳酸鈣維D能有效對(duì)抗環(huán)磷酰胺致大鼠皮質(zhì)骨的一系列病變。我們以前的研究也發(fā)現(xiàn)鈣劑與維生素D聯(lián)用可防治環(huán)磷酰胺小鼠骨丟失［3］。補(bǔ)充鈣與維生素D是防治老年性骨質(zhì)疏松的基礎(chǔ)治療方法，目前認(rèn)為其作用機(jī)制主要包括維生素D3在體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為具有促進(jìn)骨形成活性1，25-(OH)2D3，以及鈣的補(bǔ)充可保證充足的礦物質(zhì)沉積到骨骼，幫助骨骼礦化。而這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也可從側(cè)面佐證環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的大鼠骨質(zhì)疏松模型是抑制成骨細(xì)胞活性為主的低轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松，其機(jī)制類(lèi)似于老年性的骨質(zhì)疏松。

由MAS組、LAS組對(duì)比CP組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，中、低劑量的阿司匹林均可有效地促進(jìn)環(huán)磷酰胺大鼠皮質(zhì)骨的骨形成礦化作用，從而避免了因成骨不足而引起的骨髓腔擴(kuò)大，皮質(zhì)骨管壁變薄，骨有機(jī)質(zhì)和無(wú)機(jī)物等比例丟失等現(xiàn)象，且中、低兩種劑量的作用無(wú)明顯區(qū)別，均與碳酸鈣維D的效果相當(dāng)。其作用機(jī)制可能與阿司匹林抗氧化損傷作用有關(guān)［10］。由Tab 3的結(jié)果可知，阿司匹林在對(duì)抗環(huán)磷酰胺對(duì)大鼠皮質(zhì)骨質(zhì)量的影響上，低劑量的效果要優(yōu)于中劑量，特別是對(duì)骨韌性和骨材料力學(xué)性能的作用上效果比碳酸鈣維D更佳。低劑量的阿司匹林(相當(dāng)于正常人100 mg·d-1)不僅能有效地修復(fù)環(huán)磷酰胺大鼠股骨抗變形和抗骨折等能力，不會(huì)降低骨的韌性，而且同時(shí)提高了骨材料力學(xué)的性能，即低劑量的阿司匹林對(duì)大鼠骨質(zhì)量修復(fù)的作用除了增加皮質(zhì)骨體積，使骨結(jié)構(gòu)變粗之外，同時(shí)也改善了骨骼的微觀結(jié)構(gòu)，增加單位骨量，使整體和單位體積皮質(zhì)骨的質(zhì)量均能有效提高。而這個(gè)劑量也恰好是阿司匹林在預(yù)防心血管事件中的推薦劑量(75～150 mg·d-1)，這或許能給阿司匹林在臨床上的應(yīng)用提供一些新的提示。而阿司匹林能否作為抗骨質(zhì)疏松藥物應(yīng)用于臨床，其促骨形成的作用原理如何?以及能否對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，或與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用來(lái)發(fā)揮更好的抗骨質(zhì)疏松效果?均有待進(jìn)一步的研究探討。

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