黃芪有效成分對缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元cyt-c、CcO表達的影響

焦俊霞，高維娟，錢 濤，朱炎杰，董雅潔

(承德醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北承德 067000)

黃芪是傳統(tǒng)中藥，具有補氣生陽、益氣固表、抗毒生肌之功能。另外，黃芪提取物黃芪注射液(每1 ml相當(dāng)于2 g生藥)主要成分為黃芪皂苷和黃芪多糖等，具有擴張微細動脈、改善微循環(huán)、增強心肌收縮力、降低血小板黏滯度和保護紅細胞變形能力等功能，臨床上多用于治療心、腦血管疾病。張雅麗等［1］黃芪注射液可以抑制缺氧缺糖后復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)細胞的凋亡，但其干預(yù)海馬神經(jīng)細胞凋亡機制，目前尚不清楚。本實驗通過對原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元建立缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖模型來模擬腦缺血/再灌注病理生理過程，觀察黃芪注射液對缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元 cyt-c(cytochrome c)、CcO(cytochrome c oxidase)表達的影響，探討黃芪有效成分抑制神經(jīng)細胞凋亡的分子機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物SD大鼠，新生1～2 d，♀♂兼有，SPF級動物，由天津山川紅實驗動物科技有限公司提供，許可證號:SCXK(津)2009-001。

1.2試劑和儀器小鼠抗大鼠cyt-c單克隆抗體購于Santa Cruz公司;BCA蛋白定量試劑盒購于上海申能博彩生物公司;cyt-c引物是由上海生物工程有限公司設(shè)計;TRIzol購自 Invitrogen公司，批號:15596-026;RT-PCR試劑盒購自大連寶生物公司，批號:DRR019A;多聚賴氨酸、批號P2636、阿糖胞苷、批號C1468，均購自美國Sigma公司;胎牛血清、馬血清由Hyclone公司生產(chǎn);谷氨酰胺、胰蛋白酶購自華美生物工程公司;DMEM/F12培養(yǎng)基、B27由美國Gibco公司生產(chǎn);免疫組化染色試劑盒購自北京中杉金橋公司;黃芪注射液由成都地奧九泓制藥廠生產(chǎn)，生產(chǎn)批號:國藥準(zhǔn)字z51021776;其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)取新生24 h的乳鼠放進冰浴的體積分?jǐn)?shù)為75%酒精內(nèi)浸泡1 min消毒，用眼科顯微鑷夾取海馬組織，吸去上層D-Hanks液，放入與海馬組織體積10倍的0.125%胰蛋白酶消化10～15 min，同時用眼科剪剪切海馬組織到1 mm3大小，用馬血清終止消化，把組織塊混合液移入離心管，1 000 r·min-1離心5 min，離心3 次，去上清后加入DMEM/F12溶液5 ml，用吹打管反復(fù)吹打70次制成細胞懸液，以200目濾網(wǎng)過濾。取10 μl細胞懸液臺盼藍染色計算活細胞數(shù)，接種到培養(yǎng)瓶(皿)。

1.4缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖細胞模型的建立與實驗分組把原代培養(yǎng)8 d的大鼠海馬神經(jīng)元隨機分為4組:正常對照組、模型組、黃芪注射液組和黃芪注射液溶劑對照組。除正常對照組外均參照Bossenmeyer等［2］的方法建立缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖細胞模型:用無糖Earle's液代替正常培養(yǎng)液，隨即把培養(yǎng)皿(瓶)置于37℃溫箱中的缺氧裝置里，快速通入高純氮氣5 min，再使氣體勻速緩慢連續(xù)排出。缺氧缺糖30 min后，換正常無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。正常對照組正常培養(yǎng)，不進行任何處理;黃芪注射液組于缺氧缺糖時加入黃芪注射液［0.5 g(生藥)·L-1］［1］，直至培養(yǎng)結(jié)束;黃芪注射液溶劑對照組處理方法與黃芪注射液組相同，只是將黃芪注射液換為pH值7.4的等量黃芪注射液溶劑即無菌去離子水;模型組在缺氧缺糖時加入與正常培養(yǎng)液等量的Earle's液，缺氧缺糖后正常培養(yǎng)。各組在復(fù)氧復(fù)糖后0、0.5、2、6、24、72 和 120 h 檢測 cyt-c、CcO 的表達。

1.5免疫細胞化學(xué)檢測海馬神經(jīng)元NSE及cyt-c表達采用SP法檢測cyt-c，具體操作均按試劑盒說明書進行。兔抗大鼠NSE多克隆抗體按1∶50稀釋，小鼠抗大鼠cyt-c單克隆抗體按1∶400稀釋;PBS代替一抗作陰性對照。陽性細胞胞質(zhì)和突起呈棕黃色，胞核有少許黃色顆粒。陽性性表達方法:高倍鏡下計算5個非連續(xù)視野陽性表達面積之和與5個視野面積之和的平均比值。采用MiVnt圖像分析系統(tǒng)對免疫組化陽性結(jié)果進行半定量分析。

1.6蛋白免疫印跡法檢測海馬神經(jīng)元cyt-c蛋白的表達收集細胞，提取胞質(zhì)蛋白，用BCA法進行蛋白定量。取30 μg樣品，以15%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，分離的蛋白用半干電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，0.5%脫脂奶粉封閉2 h，小鼠抗大鼠cyt-c單克隆抗體(1∶300稀釋)，4℃過夜。用山羊抗小鼠鼠的二抗(1∶5 000稀釋)室溫孵育1 h，洗膜液洗后用ECL發(fā)光液顯色，X射線底片曝光。以βactin為內(nèi)參照，實驗重復(fù)5次。用凝膠分析軟件Quantity one進行定量分析。

1.7RT-PCR法檢測細胞內(nèi)CcO mRNA的表達收集細胞，用TRIzol一步法提取RNA，按TaKaRa RNA PCR kit(AMV)說明逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。內(nèi)參照β-actin 上游引物 5'-CATCCTGCGTCTGGACCT-3'，下游引物5'-TCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3'，擴增片段長度為480 bp。擴增條件:94℃ 2 min;94℃ 30 s;58℃ 30 s;72℃ 4 min，循環(huán)35次。CcO上游引物5'-GGCAGAATGTTGGCTACCAGG-3'，下游引物 5'-GCCCACCACTGTCTTCCACTCAT-3'，擴增片段長度為321 bp。擴增條件:95℃ 2 min;94℃ 30 s;57℃30 s;72℃ 4 min，最后于72℃延伸3 min，循環(huán)35次。用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，實驗重復(fù)5次。用凝膠分析軟件Quantity one進行定量分析。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理實驗結(jié)果以xˉ±s表示，用SPSS 13.0軟件進行多因素方差分析，方差齊者用LSD檢驗，方差不齊者用Games-Howell檢驗。

2 結(jié)果

2.1海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)純度鑒定免疫組化染色結(jié)果顯示:無血清培養(yǎng)8 d的海馬神經(jīng)元胞體飽滿，突起明顯、突起末端分支形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，相互支持生長，神經(jīng)膠質(zhì)細胞少見，5個400倍視野中陽性神經(jīng)細胞的數(shù)目為72個，純度為(91.48±0.72)%，見 Fig 1。

Fig 1 The expression of NSE protein

2.2細胞免疫化學(xué)檢測海馬神經(jīng)元cyt-c蛋白表達免疫組化染色結(jié)果顯示:與正常對照組比，模型組除0 h外其余各時間點cyt-c蛋白表達明顯增高(P＜0.05);與模型組比，黃芪注射液組除0 h外其余各時間點cyt-c蛋白表達降低(P＜0.05)，而黃芪注射液溶劑對照組無明顯差異(P＞0.05)，見Fig 2、3。

2.3黃芪注射液對缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元cyt-c蛋白表達的影響Western blot實驗結(jié)果顯示:cyt-c蛋白表達趨勢與細胞免疫化學(xué)表達一致，見 Fig 4、5。

2.4黃芪注射液對缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元CcO mRNA表達的影響RT-PCR結(jié)果顯示:CcO mRNA同cyt-c蛋白表達趨勢一致，見Fig 6、7。

3 討論

腦血管病是神經(jīng)系統(tǒng)常見病、多發(fā)病、其致死率、致殘率均較高，缺血造成了腦組織的損傷，再灌注更使可逆性缺血損傷加重，并通過各種反應(yīng)將可逆性損傷轉(zhuǎn)化為不可逆性損傷。研究表明，線粒體在真核細胞凋亡過程中起著樞紐作用，線粒體通路在神經(jīng)細胞凋亡控制中發(fā)揮決定性作用［3］。

線粒體在細胞凋亡過程中起最基本的作用，其關(guān)鍵性分子是cyt-c，而主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其中JNK3的表達與神經(jīng)元凋亡關(guān)系十分密切，葉冬青［4］等研究表明，缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖可通過增加JNK3表達而誘發(fā)神經(jīng)元凋亡。在鈣離子超載、氧自由基等應(yīng)激刺激下，細胞通過MAPK(Mitogen-activated protein kinases，MAPK)、MKK4(Mitogen-activated protein kinase kinase-4，MKK4)和MKK7(mitogen-activated protein kinase kinase7，MKK7)，使 JNK(c-Jun N terminal kinase，JNK)和p38三肽區(qū)的蘇氨酸/酪氨酸雙磷酸化而激活JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［5］，表達于細胞質(zhì)的JNK3被磷酸化而激活后逐漸轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)，使高電導(dǎo)非選擇性通道PTP(permeability transition pore，PTP)開放和線粒體膜電位崩解［6］，水分進入導(dǎo)致線粒體外膜斷裂cyt-c和AIF(apoptotic inducing factor)釋放入胞質(zhì)。進入胞質(zhì)的cyt-c與凋亡酶激活因子-1(apoptotic protease activating factors-1，APAF-1)結(jié)合并將其激活，然后又結(jié)合輔助因子dATP/ATPAPA構(gòu)成凋亡小體，其中的APAF-1招募procaspase-9在凋亡小體上寡聚［7］，procaspase-9發(fā)生同源活化，其進一步激活下游的效應(yīng)胱天蛋白酶caspase-3，進而活化caspase-6、7使細胞走向凋亡［8］。他們通過激活一系列下游基因發(fā)揮調(diào)節(jié)凋亡作用。

Fig 2 The effect of astragalus injection on expression of cyt-c protein after hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation in hippocampal neurons of rats(×400，n=5)

Fig 3 The effect of astragalus injection on mean optic density of cyt-c protein after hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation in hippocampal neurons of rats(±s，n=5)

Fig 4 The effect of astragalus injection on expression of cyt-c protein after hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation in hippocampal neurons of rats

Fig 5 The effect of astragalus injection on mean optic density of cyt-c protein after hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation in hippocampal neurons of rats(±s，n=5)

Fig 6 The effect of astragalus injection on expression of CcO mRNA after hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation in hippocampal neurons of rats

Fig 7 The effect of astragalus injection on mean optic density of CcO mRNA after hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation in hippocampal neurons of rats(±s，n=5)

此外，線粒體是有氧呼吸產(chǎn)生能量的主要場所，cyt-c與CcO均是呼吸鏈的電子傳遞體，其中CcO是呼吸鏈末端的限速酶，定位于線粒體表面參與線粒體的呼吸氧化作用，在細胞凋亡中起極其重要的作用。在缺血缺氧時，線粒體膜通透性增加，大量CcO釋放入細胞胞質(zhì)，阻斷呼吸鏈電子傳遞，細胞能量供應(yīng)減少，最終導(dǎo)致細胞凋亡。李慢等［9］，電鏡酶細胞化學(xué)法顯示創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙模型大鼠藍斑神經(jīng)元線粒體CcO大量釋放入胞質(zhì)，RT-PCR方法表明在凋亡高峰出現(xiàn)前CcO的釋放達到最多。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃芪所含的黃芪皂苷類和黃芪多糖具有擴張血管、清除體內(nèi)氧自由基、減少血栓形成、改善腦血流、降低血脂、改善微循環(huán)等多重作用［10］。黃芪注射液為中藥黃芪提取物制成的針劑，具有益氣養(yǎng)元、扶正祛邪、通脈養(yǎng)心、健脾利濕的作用。黃芪注射液每1 ml相當(dāng)于生藥2 g，張雅麗等［1］研究證實黃芪注射液可提高細胞的活性，抑制缺氧缺糖后復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)細胞的凋亡。

本實驗以大鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)為基礎(chǔ)，通過對培養(yǎng)細胞施加缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖因素來模擬腦缺血/再灌注病理生理過程，海馬神經(jīng)元在缺氧缺糖后復(fù)氧復(fù)糖0 h細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路未啟動，故各組cyt-c蛋白及CcO mRNA表達比較無明顯差異。復(fù)氧復(fù)糖0.5 hcyt-c隨細胞凋亡信號的啟動而開始升高，CcO釋放入胞質(zhì)。隨著復(fù)氧復(fù)糖時間延長，進一步發(fā)揮凋亡信號傳遞過程，模型組cyt-c蛋白及CcO mRNA表達進一步增高6 h達高峰，復(fù)氧復(fù)糖24、72、120 h表達逐漸降低但仍高于正常組。黃芪有效成分可降低缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖后除0 h外各時間點cyt-c、CcO的表達。本實驗研究表明黃芪有效成分可通過抑制CcO mRNA及cyt-c蛋白的表達，提高線粒體CcO活性，從而抑制CcO釋放入胞質(zhì)，發(fā)揮抗神經(jīng)細胞凋亡的作用。

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