綠原酸對缺氧環(huán)境下干細(xì)胞來源軟骨樣細(xì)胞凋亡的影響

劉 哲，李士勇，宋玉林，廖新根，陳偉才，顧玉榮，殷 明

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院1.骨科、2.分子中心，江西南昌 330006)

軟骨細(xì)胞是構(gòu)成關(guān)節(jié)軟骨的基礎(chǔ)，因其高度分化增殖能力低下造成軟骨的再生能力差，使得軟骨損傷后難以自然修復(fù)。干細(xì)胞及其來源軟骨細(xì)胞移植治療解決了軟骨細(xì)胞低增殖力問題，已成為臨床上治療軟骨損傷的有效方法［1］。研究發(fā)現(xiàn)體外氧環(huán)境下培養(yǎng)的細(xì)胞移植進(jìn)入類似關(guān)節(jié)腔內(nèi)缺氧環(huán)境［2］后活性及存活率均下降［3-4］，Wakitani等［5］認(rèn)為移植細(xì)胞低存活率使得干細(xì)胞分化的軟骨的厚度、機(jī)械強(qiáng)度等均不及正常軟骨，所以細(xì)胞移植的低存活率是制約這一方法應(yīng)用的因素。綠原酸(chlorogenic acid，CGA)為苯丙素類極性有機(jī)酸，具有強(qiáng)抗氧化能力可抑制氧化應(yīng)急引起的凋亡［6］。綠原酸對缺氧環(huán)境下細(xì)胞內(nèi)活性氧改變引起的凋亡的作用，目前還不清楚。本實(shí)驗(yàn)擬體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞為軟骨樣細(xì)胞，0.1%O2缺氧環(huán)境下模擬關(guān)節(jié)腔內(nèi)的缺氧環(huán)境模型，觀察綠缺氧環(huán)境下原酸對軟骨樣細(xì)胞的作用，探討其對軟骨細(xì)胞的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1藥物及試劑骨髓間充質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)全骨沖洗法取自健康SD大鼠(5周，♀，60 g)，南昌大學(xué)提供(清潔級);DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶(Gibco公司);胎牛血清(Hyclone公司);骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(北京義翹神州生物技術(shù)有限公司);25 ml培養(yǎng)瓶、24孔板(Corning公司);Alcian Blue 8GX(索萊寶公司);一抗β-actin抗體、Ⅱ型膠原蛋抗體，二抗(博士德公司);PVDF膜0.45 μm(Millipore公司);ECL(Pierce公司);5x蛋白上樣緩沖液、活性氧檢測試劑盒、Hoechst33258染色試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所);Bcl-2、Caspase-3、β-actin的引物由上海生工生物科技有限公司合成，Bcl-2上游引物:5'-GGTACCGGAGAGCGTTCAGT-3'，下游引物:5'-CTGCTGCATTGTTCCCGTAG-3';Caspase-3上游引物5'-AGCTTCTTCAGAGGCGACTA-3':下游引物:5'-GGACACAATACACGGGATCT-3';β-actin上游引物:5'-TGTCA CCAACTGGGACGATA-3'，下 游 引 物:5'-GGGGTGTTGAAGGTCT-3'。

1.2實(shí)驗(yàn)分組及藥物處理骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞全骨髓法取自健康SD大鼠，椎脫臼處死后體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇浸泡30 min消毒，無菌下取出四肢長骨，PBS沖洗，待沖洗液顏色不再加深后，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清加入10%FBS的DMEM重懸后滴入培養(yǎng)瓶貼壁培養(yǎng)，傳至第2代加入DMEM誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含5%小牛血清、0.2 mg·L-1BMP-2)，置于37℃、5%CO2及飽和濕度孵育箱中，隔日換誘導(dǎo)液，12 d。0.1%O2缺氧是使用空氣混勻器，設(shè)定總氣體流量為2 000 ml·min-1，其中N2流量為1 880 ml·min-1，CO2流量為 100 ml·min-1，O2流量為20 ml·min-1，調(diào)整完畢后，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于缺氧盒內(nèi)，檢查完氣密性后沖入混勻低氧氣體，5 min后密閉缺氧盒以達(dá)到。實(shí)驗(yàn)分4組:A(正常對照組):實(shí)驗(yàn)中不加任何物質(zhì)干預(yù);B(綠原酸組):在細(xì)胞培養(yǎng)液中含終濃度為10 mg·L-1的綠原酸;C(缺氧處理組):實(shí)驗(yàn)中不加任何物質(zhì)干預(yù)置于0.1%O2缺氧環(huán)境下培養(yǎng)12 h;D(綠原酸+缺氧處理組):在細(xì)胞培養(yǎng)液中含終濃度為10 mg·L-1的綠原酸置于0.1%O2缺氧環(huán)境下培養(yǎng)12 h。

1.3Alcian Blue檢測軟骨分化Alcian Blue能夠特異性對硫酸葡萄糖胺聚糖(sulfate glyeosaminglycans)染色，是軟骨細(xì)胞特異性的染料。取誘導(dǎo)0 d、6 d、12 d的細(xì)胞，PBS洗兩遍，加1%Alcian Blue溶液染色30 min;3%冰醋酸溶液洗30 s×3;顯微鏡下觀察、拍照。

1.4Western blot檢測Ⅱ型膠原蛋白提取誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)6 d、12 d細(xì)胞的蛋白，標(biāo)準(zhǔn)曲線測定樣品濃度，-20℃儲存;上樣量均為30 μg，90 伏 ～120 伏SDS-PAGE電泳(6%分離膠和5%的濃縮膠);250 mA恒流電轉(zhuǎn)膜3 h，5%牛奶封閉，分別一抗Ⅱ型膠原蛋抗體(1∶300)，二抗(1∶5 000)，堿性磷酸酶顯色系統(tǒng)顯色，顯定影后掃描分析。

1.5活性氧檢測各分組去除培養(yǎng)液后加入DMEM稀釋好的 DCFH-DA(終濃度為10 μmol·L-1)，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min后吸盡液體，用無血清DMEM洗滌3次。使用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察(488 nm激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長)。

1.6Hoechst33258熒光染色觀察細(xì)胞凋亡各分組去除培養(yǎng)液PBS洗兩遍，吸盡，加入固定液10 min;吸盡后PBS洗2次，每次3 min，吸盡;加入Hoechst 33258染色15 min(置于搖床上)，吸盡;用PBS洗2次，每次3 min，吸盡;加入抗熒光淬滅封片液。熒光顯微鏡下檢測骨髓間充質(zhì)細(xì)胞來源軟骨樣細(xì)胞凋亡情況(激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長460 nm)。隨機(jī)選取5個視野，計(jì)數(shù)100個細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞凋亡率/%=凋亡的細(xì)胞數(shù)/總的細(xì)胞數(shù)×100% ，取5次結(jié)果的平均值。

1.7RT-PCR檢測Bcl-2、Caspase-3的mRNA表達(dá)水平收集各分組細(xì)胞，TRIzol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后PCR。PCR反應(yīng)體系:Mix:10 μl，cDNA:1.5 μl，上下游引物各 1 μl，dd H2O:6.5 μl，總計(jì) 20 μl。取 PCR 產(chǎn)物，1.5% 瓊脂糖凝膠電泳40 min，內(nèi)參照為β-actin基因。使用GDS8000凝膠自動成像系統(tǒng)掃描分析并相應(yīng)處理。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以±s表示，差異性分析選用One-way ANOVA test進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1Alcian Blue染色檢測BMP-2誘導(dǎo)BMSCs的軟骨分化Alcian Blue是軟骨細(xì)胞特異性染料，能夠?qū)浌腔|(zhì)的特征性標(biāo)志硫酸葡萄糖胺聚糖染色。光鏡下觀察:誘導(dǎo)前BMSCs經(jīng)Alcian Blue處理未被染色，形態(tài)呈梭狀或類成纖維狀;誘導(dǎo)6 d后胞體較BMSCs變大呈不規(guī)則類圓形，呈淡染;誘導(dǎo)12 d較前胞體變大形態(tài)不規(guī)則，深染。說明在進(jìn)行誘導(dǎo)后硫酸葡萄糖胺聚糖含量明顯增高且與誘導(dǎo)時間呈正比，間充質(zhì)干細(xì)胞在誘導(dǎo)后可分化為軟骨細(xì)胞。見Fig 1A。

Fig 1A Evaluation after induction of differentiated chondrogenic MSCs

2.2Western blot檢測BMP-2誘導(dǎo)BMSCs表達(dá)Ⅱ型膠原蛋白Ⅱ型膠原蛋白(Collagen 2al，Col2a1)是軟骨分化過程中的特征性分子指標(biāo)。結(jié)果顯示:誘導(dǎo)前BMSCs無Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá);誘導(dǎo)6 d后Ⅱ型膠原蛋白有較高的表達(dá);誘導(dǎo)12 d細(xì)胞較誘導(dǎo)前Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)有增加。說明經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后，間充質(zhì)干細(xì)胞分化為軟骨樣細(xì)胞。見Fig 1B。

2.3活性氧檢測DCFH-DA入細(xì)胞后被酯酶水解成不能透膜的無熒光DCFH，其被細(xì)胞內(nèi)活性氧氧化生成有熒光的DCF，DCF熒光水平即細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。熒光結(jié)果:A組:出現(xiàn)均勻的低強(qiáng)度熒光，細(xì)胞內(nèi)活性氧水平低;B組:出現(xiàn)均勻的低強(qiáng)度熒光，與A正常對照組比較差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，細(xì)胞內(nèi)活性氧水平低;C組:有大量的高強(qiáng)度的熒光，與正常對照組比細(xì)胞內(nèi)活性氧水平急劇增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);D組:有較少量強(qiáng)度高的熒光，但較C組熒光強(qiáng)度明顯降低，比A、B組升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說明綠原酸對更換低氧培養(yǎng)環(huán)境引起的細(xì)胞內(nèi)活性氧增高有一定的保護(hù)作用;見Fig 2。

Fig 1B Expressions of typeⅡcollagen protein were examined at 0，6，and 12 days

Fig 2 Effects of CGA on ROS in differentiated chondrogenic MSCs

2.4Hoechst33258熒光染色觀察細(xì)胞凋亡Hoechst33258為可特異性結(jié)合DNA分子的水溶性熒光探針。凋亡細(xì)胞因核濃縮與Hoechst 33258結(jié)合增強(qiáng)，在熒光顯微鏡下染色呈強(qiáng)藍(lán)色熒光;正常細(xì)胞呈微弱熒光，死細(xì)胞不被染色。本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞熒光染色結(jié)果:A組:出現(xiàn)均勻的低強(qiáng)度熒光，細(xì)胞核較大，細(xì)胞凋亡率為(4.07±2.036)，凋亡細(xì)胞數(shù)目極少;B組:可見數(shù)目極少的較高強(qiáng)度的藍(lán)色亮點(diǎn)，細(xì)胞凋亡率為(6.89±2.503)，與A正常對照組比較差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);C組:有數(shù)目較多的高強(qiáng)度的藍(lán)色亮點(diǎn)，細(xì)胞凋亡率為(87.92±19.08)，有大量的細(xì)胞發(fā)生凋亡，與正常對照組進(jìn)行比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);D組:有較少的強(qiáng)度高的藍(lán)色亮點(diǎn)，細(xì)胞凋亡率為(53.62±12.208)，與0.1%O2缺氧環(huán)境培養(yǎng)組進(jìn)行比較凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯減少，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，可見綠原酸對0.1%O2缺氧環(huán)境培養(yǎng)引起的凋亡具有一定的保護(hù)作用;見 Fig 3、4。

Fig 3 Hoechst33258 nuclear staining for assessment of apoptosis of chondrogenic MSCs

Fig 4 The rate of apoptosis in differentiated chondrogenic MSCs(n=5)

2.5RT-PCR檢測Caspase-3、Bcl-2的mRNA表達(dá)水平將各組處理12 h后:與A組進(jìn)行比較，B組的Caspase-3的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。Bcl-2的表達(dá)水平有提高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)說明綠原酸能上調(diào)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞來源的軟骨細(xì)胞的Bcl-2的低表達(dá);與A組進(jìn)行比較，C組的Caspase-3的表達(dá)水平增強(qiáng)、Bcl-2的表達(dá)水平明顯減弱，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，可見0.1%O2缺氧環(huán)境能促使骨髓間充質(zhì)細(xì)胞來源的軟骨細(xì)胞Caspase-3表達(dá)增強(qiáng)、Bcl-2的表達(dá)減弱;D組與C組進(jìn)行比較，D組的Caspase-3的表達(dá)水平明顯降低、Bcl-2的表達(dá)水平增強(qiáng)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);D組與A組相比，D組的Caspase-3與Bcl-2表達(dá)增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。說明綠原酸下調(diào)0.1%O2缺氧環(huán)境引起的Caspase-3的高表達(dá)以及上調(diào)0.1%O2缺氧環(huán)境引起B(yǎng)cl-2的低表達(dá);見Fig 5。

Fig 5 Effect of CGA on Bcl-2 and Caspase-3 expression in differentiated chondrogenic MSCs(n=5)

3 討論

Lengner等［7］使用BMP-2高密度培養(yǎng)的條件下夠誘導(dǎo)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞MEFs分化為軟骨細(xì)胞，證實(shí)BMP-2具有誘導(dǎo)具有多向分化潛能的細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的能力。本實(shí)驗(yàn)采用0.2 mg·L-1BMP-2對骨髓間充質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)12 d。行軟骨細(xì)胞特異性Alcian Blue染色以及Ⅱ型膠原蛋白的檢查，誘導(dǎo)后的細(xì)胞Alcian Blue染色、Ⅱ型膠原蛋白均為陽性且與誘導(dǎo)時間成正比，說明誘導(dǎo)后骨髓間充質(zhì)細(xì)胞分化為軟骨樣細(xì)胞。

關(guān)節(jié)腔損傷后其內(nèi)為極低氧環(huán)境［2］，本實(shí)驗(yàn)使用0.1%O2的缺氧環(huán)境來模擬這一環(huán)境。Greijer發(fā)現(xiàn)缺氧的嚴(yán)重程度直接決定著細(xì)胞凋亡與否，在0.5%O2的缺氧環(huán)境下可以啟動細(xì)胞的凋亡［8］，所以認(rèn)為0.1%O2的缺氧環(huán)境可誘發(fā)細(xì)胞的凋亡。本實(shí)驗(yàn)將誘導(dǎo)后的細(xì)胞放在0.1%O2的缺氧環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)12 h，凋亡率為87.92%，認(rèn)為凋亡模型成立。

綠原酸(chlorogenic acid，CGA)為杜仲、金銀花等中藥中的主要有效成分，含有R-OH基，有消除羥基自由基、降低超氧陰離子等自由基的活性等的強(qiáng)抗氧化能力，對氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡起到保護(hù)作用［9］。本實(shí)驗(yàn)中，未做處理的骨髓間充質(zhì)來源軟骨樣細(xì)胞在0.1%O2的缺氧環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)12 h，凋亡率為87.92%。加入綠原酸終濃度為10 mg·L-1相同條件、時間下培養(yǎng)，其凋亡率為53.62%，較未加綠原酸處理組明顯下降。

Henrotin等［10］在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)更換氧濃度培養(yǎng)環(huán)境至極低氧環(huán)境下，培養(yǎng)液內(nèi)氧張力急劇變化，活性氧等水、氧化還原狀態(tài)水平發(fā)生改變，可使細(xì)胞凋亡。線粒體膜電位的下降被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)中的早期表現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的變化可導(dǎo)致胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變，細(xì)胞液由還原環(huán)境轉(zhuǎn)為氧化環(huán)境這可能導(dǎo)致了凋亡早期細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的下降以并引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫等，啟動凋亡效應(yīng)器caspase的級聯(lián)反應(yīng)［11-12］。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在加入綠原酸后骨髓間充質(zhì)細(xì)胞來源的軟骨樣細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)活性氧水平檢測加綠原酸組亦明顯降低。

Bcl-2蛋白為凋亡抑制蛋白，通過調(diào)控谷胱甘肽的水平控核內(nèi)氧化還原平衡從而控制Caspase的活性抑制凋亡［13］。Caspase是具有半胱氨酸殘基類似結(jié)構(gòu)，能夠特異性的切割靶蛋白蛋白天冬氨酸殘基后的肽鍵的蛋白酶，在凋亡中起著關(guān)鍵作用，其中caspase-3是細(xì)胞凋亡中最重要的終末剪切酶［14］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在缺氧環(huán)境下加入綠原酸保護(hù)后Bcl-2表達(dá)水平明顯高于未加入，而caspase-3表達(dá)水平遠(yuǎn)低于未加入組。

綜上所述，綠原酸可能通過降低超氧陰離子等自由基的活性水平以控制細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平，穩(wěn)定細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)來保護(hù)線粒體膜電位等，并促進(jìn)凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)及抑制Caspase-3的表達(dá)，共同起到抗凋亡作用。隨著對綠原酸及抗凋亡基礎(chǔ)研究的不斷深入，為促進(jìn)缺氧環(huán)境下種子細(xì)胞的存活能力的提高開辟思路和尋找到新策略。

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