霜制對(duì)苦杏仁中苦杏仁苷在大鼠尿液中的代謝與排泄影響

付志玲， 鄭曉暉， 房敏峰

（西部資源生物與現(xiàn)代生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710069）

霜制對(duì)苦杏仁中苦杏仁苷在大鼠尿液中的代謝與排泄影響

付志玲， 鄭曉暉*， 房敏峰*

（西部資源生物與現(xiàn)代生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710069）

目的 探討霜制對(duì)苦杏仁中苦杏仁苷在大鼠尿液中的代謝與排泄影響。方法 將SD大鼠分別注射苦杏仁苷、灌胃苦杏仁生品及霜制品水煎液，于不同時(shí)間段收集尿液，HPLC測(cè)定尿液中馬尿酸、苦杏仁苷及其代謝產(chǎn)物野櫻苷，LCMSn鑒定代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。結(jié)果 苦杏仁苷注射給藥后主要以原型排泄，馬尿酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)無明顯變化；苦杏仁生品與霜制品灌胃給藥后主要以代謝產(chǎn)物野櫻苷的形式排泄，馬尿酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)有顯著增長(zhǎng)，且霜制后野櫻苷的排泄時(shí)間延遲。結(jié)論 霜制對(duì)苦杏仁中苦杏仁苷的排泄有較大影響。

苦杏仁；霜制；代謝；高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

苦杏仁鎮(zhèn)咳祛痰的有效成分為苦杏仁苷［1］，經(jīng)霜制脫脂滅酶后有效成分顯著提高［2］?？嘈尤噬芳八破房诜笤谘汉徒M織中均未檢出苦杏仁苷原型，而檢出了野櫻苷，且該成分在8 h內(nèi)穩(wěn)定存在［3］。但野櫻苷是苦杏仁苷在體外水解的中間產(chǎn)物，極不穩(wěn)定［4］。因此，有必要通過尿液代謝檢測(cè)不同炮制品中苦杏仁苷的代謝終產(chǎn)物，據(jù)此推測(cè)苦杏仁苷的體內(nèi)代謝過程，探討苦杏仁霜制機(jī)理。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1100系列高效液相色譜-電噴霧-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀；島津LC-10AT vp高效液相色譜儀；SPD-10A vp紫外檢測(cè)器；SHIMADZU CBM-102色譜工作站（日本Shimadzu Corpration）；DXL-10大鼠代謝籠（上海科科醫(yī)學(xué)模型有限公司）；HC-3018高速離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司）。

1.2 試藥

苦杏仁苷對(duì)照品，購自中國(guó)藥品生物制品檢定所（批號(hào)110820-200403）；馬尿酸對(duì)照品（純度大于98.5%，購于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)F20080624）；苦杏仁藥材（購于陜西省藥材公司，由陜西省藥品檢驗(yàn)所鑒定）；色譜甲醇（美國(guó)Fisher公司，批號(hào)086955）；實(shí)驗(yàn)用水為超純蒸餾水（自制）；其他試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

SD大鼠，雌雄兼用，體質(zhì)量200～220 g，由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：醫(yī)動(dòng)字第09-003號(hào)。

2 方法

2.1 色譜條件

Thermo Hypersil GOLD Cl8色譜柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水-甲酸（13 ∶87 ∶0.1）；體積流量 0.8 mL/min；柱溫 25 °C；檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm；進(jìn)樣量 10 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源；正離子模式；噴霧電壓 3.5 kv，干燥氣體積流量 8.0 L/min，干燥氣溫度350℃；霧化氣壓力35.0 Psi；質(zhì)量掃描范圍50～1 000 amu；流動(dòng)相：甲醇-水-甲酸-甲酸銨（13 ∶87 ∶0.1 ∶0.1）；體積流量 0.8 mL/min，入質(zhì)譜分流比例為3∶1；柱溫25 °C。

2.2 藥材供試品溶液的制備

取苦杏仁和苦杏仁霜適量，搗碎，加沸水回流提取2次，每次15 min，濾過，濃縮，制得質(zhì)量濃度為1 g生藥/mL的不同炮制品供試溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性

在擬定色譜條件下，空白尿液對(duì)苦杏仁苷（tR=27.8 min）測(cè)定無干擾。馬尿酸為正常尿液中的內(nèi)源性成分，所以在空白尿液色譜圖中在與馬尿酸對(duì)照品相同保留時(shí)間處（tR=20.8 min）出現(xiàn)一色譜峰，經(jīng)LC-MS確認(rèn)為內(nèi)源性的馬尿酸，經(jīng)多份空白尿液測(cè)定，內(nèi)源性的馬尿酸峰面積相對(duì)小且恒定，故不影響觀察馬尿酸的變化?？嘈尤受蘸婉R尿酸的峰形良好。

2.3.2 線性范圍和檢測(cè)限

精密吸取苦杏仁苷和馬尿酸的系列標(biāo)準(zhǔn)尿液樣品10 μL，在擬定色譜條件下進(jìn)樣分析。以峰面積為縱坐標(biāo)（y），以苦杏仁苷和馬尿酸的濃度為橫坐標(biāo)（x，μg/mL）進(jìn)行回歸分析，空白尿液中馬尿酸的面積相對(duì)小且恒定，通過空白尿液扣除的方法得馬尿酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，結(jié)果見表1，檢測(cè)限為0.3 μg/mL。

表1 苦杏仁苷和馬尿酸的線性關(guān)系結(jié)果Tab.1 The linear relationship of amygdalin and hippunic acid

2.3.3 回收率、精密度和穩(wěn)定性

精密配制2、20、200 μg/mL 低、中、高 3 個(gè)質(zhì)量濃度的苦杏仁苷和馬尿酸的空白尿液加標(biāo)樣品各5份，在擬定分析條件下分析，記錄峰面積，由線性方程計(jì)算得到測(cè)得量，以測(cè)定值的平均值與配制的理論濃度比較，得苦杏仁苷和馬尿酸的回收率均大于89%。每日每個(gè)濃度平行測(cè)定5次，分別在6日內(nèi)連續(xù)測(cè)定5次，得日內(nèi)及日間精密度RSD均小于5%，穩(wěn)定性RSD均小于5%。

2.4 樣品的采集

取健康SD大鼠，隨機(jī)分3組，每組6只，實(shí)驗(yàn)前禁食，自由飲水。分別尾靜脈注射苦杏仁苷（100 mg/kg）；灌苦杏仁生品以及苦杏仁霜制品水煎液（7 g生藥/kg），另設(shè)2只給予生理鹽水，作為空白對(duì)照。置于大鼠代謝籠中收集給藥后0～2 h，2～4 h，4～8 h，8～12 h，12～24 h，5 個(gè)時(shí)段的尿液，分別記錄所收集尿液體積，得到含藥和空白尿液樣品，于－20°C凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 樣品預(yù)處理

取2.4項(xiàng)下所收集的尿樣適量，4 000 r/min離心10 min，取離心后的上清液用水稀釋（稀釋倍數(shù)視尿樣中的藥物濃度而定，一般為10～100倍），稀釋后用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液直接進(jìn)樣分析。

3 結(jié)果

3.1 給藥后尿液樣品的LC-MS分析

分別取2.5項(xiàng)下的尿液樣品10 μL，在擬定色譜條件下進(jìn)樣分析，結(jié)果顯示苦杏仁苷注射給藥后可在大鼠尿液中檢測(cè)到苦杏仁苷原型，馬尿酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與空白組無明顯差異；灌胃給藥苦杏仁生品和霜制品后均未檢測(cè)到苦杏仁苷原型，分別在34 min和36 min處檢測(cè)到苦杏仁苷的代謝產(chǎn)物，經(jīng)質(zhì)譜分析為野櫻苷的同分異構(gòu)體，即D-野櫻苷和L-野櫻苷［5-7］，馬尿酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯增大，見圖1。

圖1 給藥后尿液樣品的HPLC圖Fig.1 The HPLC graph of rat urine sample after mainline or oral administration

3.2 給藥后大鼠含藥尿液中馬尿酸、苦杏仁苷及野櫻苷隨時(shí)間的變化

將不同時(shí)間點(diǎn)收集到的大鼠含藥尿液分別進(jìn)行HPLC檢測(cè)。結(jié)果表明，苦杏苷注射給藥后在0～2，2～4，4～8，8～12，12～24 h 5個(gè)時(shí)間段均能檢測(cè)到明顯的苦杏仁苷原型，其中以2～4 h排出量最大，累積排出率為69.9%?？嘈尤噬泛涂嘈尤仕辔附o藥后，在5個(gè)時(shí)間段均可檢測(cè)到明顯的代謝產(chǎn)物野櫻苷，生品灌胃時(shí)以0～2 h排出量最大，而制霜后最大排出量集中在2～4 h，且灌胃給藥后尿液中馬尿酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著增大，見圖2和圖3。

3.3 苦杏仁苷在大鼠體內(nèi)的代謝過程

根據(jù)以上檢測(cè)結(jié)果，結(jié)合文獻(xiàn)［3］推測(cè)灌胃給藥苦杏仁生品與霜制品后其主要成分苦杏仁苷在大鼠體內(nèi)的代謝途徑，如圖4所示。

4 討論

圖2 大鼠灌服苦杏仁生品和霜制品后野櫻苷的累積排泄曲線Fig.2 The cumulative excretion curve of prunasin after oral raw or cream product of bitter almond by rat

4.1 某些種子類中藥由于富含大量脂肪油而具有毒性強(qiáng)、滑腸致瀉劇烈等缺點(diǎn)，中醫(yī)臨床上常通過炮制去油成霜，以達(dá)降低毒性、用藥安全的目的［8］。通常將藥材碾碎如泥狀，經(jīng)微熱后，壓去部分油脂，制成符合一定要求的松散粉未［9］。但苦杏仁苷易被苦杏仁酶水解，故在制霜時(shí)，需將生品打成較大碎粒，蒸制滅酶后，才可做脫脂處理，否則，苦杏仁霜中有效成分損失較大。

圖3 大鼠注射苦杏仁苷、灌服苦杏仁生品和霜制品后馬尿酸的累積排泄曲線Fig.3 The cumulative excretion curve of hippuric acid after amygdalin given by mainline，bitter almond and its cream product given by oral in rat

圖4 苦杏仁苷在大鼠體內(nèi)的代謝過程Fig.4 The metabolic process of amygdalin in rat

4.2 注射給藥苦杏仁苷，在尿液中主要以原型藥的形式排出，灌胃給藥苦杏仁生品和霜制品后主要是以代謝產(chǎn)物野櫻苷的形式排出，野櫻苷是苦杏仁苷的次級(jí)苷，推測(cè)是由苦杏仁苷在腸道內(nèi)代謝形成的［10］。其體內(nèi)作用過程為苦杏仁苷首先經(jīng)脫糖轉(zhuǎn)化為野櫻苷，再經(jīng)脫糖轉(zhuǎn)化為苯乙腈，苯乙腈分解生成HCN和苯甲醛，HCN發(fā)揮止咳平喘的功效，苯甲醛經(jīng)氧化生成苯甲酸，苯甲酸被輸送到肝臟后，在ATP、Mg2+、CoA的作用下，與肽鍵和甘氨酸結(jié)合生成馬尿酸排出體外，因此灌胃給藥后馬尿酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著升高。

4.3 苦杏仁生品灌胃時(shí)野櫻苷在0～2 h排出量最大，而霜制后最大排出量集中在2～4 h。即經(jīng)霜制以后，野櫻苷的排泄時(shí)間與生品有明顯不同，霜制后可使其排泄時(shí)間延遲，即藥物在體內(nèi)的作用時(shí)間延長(zhǎng)，這種影響可能與霜制可改變苦杏仁的作用趨向，增強(qiáng)其止咳平喘的功效有關(guān)，苦杏仁苷的代謝產(chǎn)物野櫻苷是否與苦杏仁止咳平喘的藥理作用相關(guān)還有待進(jìn)一步研究。

［1］楊書斌，劉 青，孫立立，等.HPLC測(cè)定苦杏仁飲片中苦杏仁苷的含量［J］.中成藥，2006，28（10）：1452-1454.

［2］張振凌.臨床中藥炮制學(xué)［M］.北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2007：206-207.

［3］房敏峰，付志玲，王啟林，等.炮制對(duì)苦杏仁中苦杏仁苷在大鼠體內(nèi)代謝的影響［J］.中國(guó)中藥雜志，2010，35（20）：2684-2688.

［4］葉定江.中藥炮制學(xué)［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2002：252-253.

［5］Ge B Y，Chen H X，Han F M，et al.Identification of amygdalin and its major metabolites in rat urine by LC-MS/MS［J］.J Chromatogr B，2007，857：281-286.

［6］Koo J Y，Hwang E Y，Cho S，et al.Quantitative determination of amygdalin epimers from armeniacae semen by liquid chromatography［J］.J Chromatogr B，2005，814：69-73.

［7］Takafumi I，Yutaka M，Keiichi Y，et al.Quantitative determination of amygdalin epimers bycyclodextrin-modified micellar electrokinetic chromatography［J］.J Chromatogr A，2001，923：249-254.

［8］賈丈欽，張松乾，趙清建.中藥炮制制霜方法的改進(jìn)［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，1991，11（7）：329-330.

［9］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：2010年版一部［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄20.

［10］Strugala G J，Stahl R，Elsenhans B，et al.Small-intestinal transfer mechanism of prunasin，the primary metabolite of the cyanogensic glycoside amygdalin［J］.Hum Exp Toxicol，1995，14：895-901.

Effect of defatted method on metabolism and excretion of bitter almond in rat

urine
FU Zhi-ling， ZHENG Xiao-hui*， FANG Min-feng*
（Key Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Western China，Ministry of Education，The College of Life Sciences，Northwest University，Xi’an 710069，China）

AIMTo explore the processing influence of removal of oil on metabolism and excretion of bitter almond in rat urine.METHODSSix SD rats were given the injection of amygdalin，other six SD rats took the perfusion of the extract of bitter almond，the third group of six SD rats took the extract of defatted bitter almond.Sample of these rats’urine was collected at various time intervals and contents of amygdalin，hippuric acid and prunasin analyzed on HPLC.LC-MS was applied to the structure analysis.RESULTSAfter drug administration，amygdain in prototype was found out in rat urine receiving injection of amygdain，hippuric acid content in rat urine continued without change.SD rats receiving perfusion excreted prunasin-metabolite of amygdain，and increased the excretion of hippuric acid。Experiment showed that the defatted bitter almond caused the excretion time interval of prunasin to be delayed.CONCLUSIONThe defatted processing may have an important effect on the excretion of amygdalin.

bitter almond；processing；metabolism；LC-MSn

R285.5

A

1001-1528（2011）07-1202-04

2010-01-20

陜西省中醫(yī)管理局基金資助項(xiàng)目（陜中醫(yī)發(fā)20072507）

付志玲（1982—），女，碩士生，從事中藥炮制研究。E-mail：fuzhiling007@163.com

*通信作者：鄭曉暉（1968—），男，教授，從事復(fù)方代謝研究。E-mail：zhengxh@nwu.edu.com

房敏峰（1967—），女，副教授，從事中藥資源與炮制研究。E-mail：fff885@126.com