姜黃對(duì)大鼠子宮內(nèi)膜異位癥影響的實(shí)驗(yàn)研究

陳 蓉， 陳景龍， 方 毅， 張沁舒， 段 恒*

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶400016；2.澳大利亞國立大學(xué)John Curtin醫(yī)學(xué)研究院）

姜黃對(duì)大鼠子宮內(nèi)膜異位癥影響的實(shí)驗(yàn)研究

陳 蓉1， 陳景龍2， 方 毅1， 張沁舒1， 段 恒1*

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶400016；2.澳大利亞國立大學(xué)John Curtin醫(yī)學(xué)研究院）

目的 通過中藥姜黃對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥的內(nèi)膜組織血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、金屬蛋白酶（MMP）-9的表達(dá)，探討其治療機(jī)理。方法 采用SD雌性大鼠子宮內(nèi)膜自體移植建立模型，成功建模3周后，隨機(jī)分為模型組（B組，n=10）；孕三烯酮組（C組，n=10）；姜黃組D組，n=12）、以假手術(shù)為空白對(duì)照組（A組，n=8），各組分別給藥3周后，檢測(cè)異位子宮內(nèi)膜組織VEGF、MMP-9的表達(dá)。結(jié)果 C、D兩組均降低異位內(nèi)膜組織VEGF、MMP-9的表達(dá)，與B組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），C、D組間P＞0.05，無明顯差異。結(jié)論 姜黃可能是通過降低VEGF、MMP-9的表達(dá)，而抑制模型大鼠異位內(nèi)膜的生長、致其萎縮，達(dá)到實(shí)現(xiàn)治療的目的。

姜黃；子宮內(nèi)膜異位癥；VEGF；MMP-9

子宮內(nèi)膜異位癥（Endometriosis，EMS）是婦科學(xué)中公認(rèn)的難治性疾病之一，雖為良性疾病，但其浸潤、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的生物學(xué)行為與惡性腫瘤有相似之處。其發(fā)病機(jī)制至今尚未闡明，促其種植和生長的因素亦未明確，發(fā)病趨勢(shì)呈逐年上升［1］。西醫(yī)治療副作用較大，中醫(yī)治療EMS，目前使用中藥復(fù)方湯劑治療的報(bào)道比較多，中藥復(fù)方大七氣湯［2］、異位寧［3］、三棱丸［4］等，而單味中藥治療 EMS 較少。姜黃是一種活血化瘀的中藥，近年來受到許多學(xué)者的關(guān)注，其主要藥理作用包括抗炎、抗氧化、降血脂、抗腫瘤、抗HIV病毒等，且毒性很低［5］，還有人報(bào)道姜黃素有抑制EMS微血管密度的作用［6］，我們?cè)谂R床運(yùn)用單味姜黃以及姜黃復(fù)方湯劑治療子宮內(nèi)膜異位癥痛經(jīng)、包塊等療效較好。為了解其治療機(jī)理，本研究通過模型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)其異位組織形態(tài)學(xué)變化和血管內(nèi)皮因子（VEGF）、金屬蛋白酶（MMP-9）的表達(dá)，以觀察姜黃對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥治療作用及其機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠，雌性，鼠齡（70±5）d，體質(zhì)量（200±20）g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK（渝）2007-0001。

1.2 藥物 中藥姜黃，購于重慶桐君閣康平大藥房，經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院中藥教研室何先元副教授鑒定認(rèn)可。煎熬前加自來水冷水浸泡0.5 h，煎煮2次，每次30 min，將兩次湯液煎煮濃縮精制為含生藥1 g/mL中藥湯劑，冷卻后放冰箱保存。孕三烯酮膠囊購于北京紫竹藥業(yè)有限公司，批號(hào)：53050104，規(guī)格為每粒 2.5 mg。

1.3 試劑 免疫組織化學(xué)SP試劑盒、抗VEGF抗體、和DAB顯色劑等均購于北京中杉金橋公司，抗MMP-9抗體購自于Santa Cruz公司。

1.4 主要儀器 紫外可見分光光度儀（英國AmershamBiosciences公司），eppendorf centrifuge 5415D高速冷凍離心機(jī)（德國）；電泳及轉(zhuǎn)膜裝置（北京六一儀器廠）；Elecsys 2010電化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析儀（美國Roche公司）；倒置顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)（日本Nikon公司）等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 EMS動(dòng)物模型的建立 將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)取40只EMS造模，用自體內(nèi)膜移植方法建立大鼠EMS動(dòng)物模型［7］。以陰道脫落細(xì)胞涂片檢測(cè)大鼠性激素周期，在大鼠動(dòng)情期以10%的水合氯醛（200 mg/kg）腹腔注射麻醉，常規(guī)消毒后，開腹，結(jié)扎一側(cè)子宮兩端，剪取長約12 mm的子宮段，剪成4 mm×4 mm的子宮組織3塊。1塊送病理檢驗(yàn)，另2塊縫于腹壁、腸壁，以黏膜面朝向腹壁、腸壁。術(shù)畢每只大鼠肌注慶大霉素0.1 mL/8萬U，連續(xù)3 d。正常飼料喂養(yǎng)3周后，打開腹腔觀察移植的異位內(nèi)膜生長情況，以異位病灶呈結(jié)節(jié)狀，或形成囊狀，囊內(nèi)有無色透明液體，囊泡體積≥10 mm3或囊內(nèi)形成多個(gè)串珠狀，周圍可見豐富血管形成，表明造模成功。40只大鼠，術(shù)后死亡3只，成功建模32只，建模成功率80%。

另取同樣8只清潔級(jí)SD雌性大鼠，作為空白對(duì)照組，進(jìn)行開腹后關(guān)腹假手術(shù)。假手術(shù)造模方法手術(shù)條件及麻醉、開腹方法均同EMS模型組，開腹后分別結(jié)扎右側(cè)子宮兩端，剪下中間的一段子宮丟棄，逐層縫合各層組織。術(shù)后仍然每只大鼠肌注慶大霉素0.1 mL/8萬U，連續(xù)3 d，預(yù)防感染。

2.2 分組與給藥 將32只建模成功大鼠隨機(jī)分為3組，B組：模型組（n=10）；C組：孕三烯酮西藥組（0.5 mg/kg，n=10）；D 組：姜黃組（5 g/kg，n=12）。8只假手術(shù)大鼠設(shè)為A組：對(duì)照組（n=8）；對(duì)照組和模型組給予等量生理鹽水，每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥3周。3周后，同樣麻醉下打開腹腔，取出子宮內(nèi)膜異位組織，用10%的福爾馬林液固定待檢測(cè)。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 組織形態(tài)學(xué)檢查 將取出的異位內(nèi)膜組織24 h內(nèi)分別常規(guī)脫水后，透明、浸蠟、包埋、切片，經(jīng)HE染色在光鏡下觀察組織學(xué)形態(tài)。

2.3.2 測(cè)定VEGF、MMP-9的表達(dá) 按試劑盒說明書要求進(jìn)行免疫組織化學(xué)法測(cè)定各組的VEGF、MMP-9。將每張切片隨機(jī)選取4個(gè)視野拍照，圖片用Image-Pro Plus軟件進(jìn)行分析。以棕黃色表示陽性為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算每張圖片的光密度值，最后計(jì)算出累積光密度值。

3 結(jié)果

3.1 肉眼觀察 造模大鼠移植物外觀空白對(duì)照組與造模成功3周時(shí)相似，但EMS模型組移植物外觀體積增大，呈囊狀內(nèi)含有液體，有的內(nèi)見血絲，有的呈透明狀，有的移植物表面有豐富血管形成，移植物與周圍組織呈廣泛黏連。姜黃組、孕三烯酮西藥組的異位子宮內(nèi)膜腺體均見體積明顯變小，腺腔變窄，細(xì)胞稀疏，分泌物較少，成萎縮狀。

3.2 鏡下觀察

3.2.1 造模后 對(duì)照組與模型子宮內(nèi)膜相比，異位的子宮內(nèi)膜其上皮細(xì)胞內(nèi)常見空泡，間質(zhì)變得較疏松，間質(zhì)內(nèi)毛細(xì)血管增生明顯；正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞為高柱狀或柱狀，黏膜層內(nèi)間質(zhì)細(xì)胞分布均勻，腺體數(shù)量多，腺腔完整，腺上皮細(xì)胞多為柱狀，見圖1。

圖1 對(duì)照組子宮內(nèi)膜與模型組異位子宮內(nèi)膜組織結(jié)構(gòu)（×400）Fig.1 The structures of normal endometrium and ectopic endometrium of rat（×400）

3.2.2 姜黃治療后 給予姜黃治療后與模型組比較異位內(nèi)膜組織上皮萎縮，血管減少，腺體數(shù)目減少，腺腔萎縮，間質(zhì)細(xì)胞小而稀疏。見圖2、圖3。

圖2 姜黃治療EMS模型大鼠后，VEGF在異位子宮內(nèi)膜中的表達(dá)情況（×400）Fig.2 The expression of VEGF in ectopic endometrium of rat after treatment

圖3 姜黃治療EMs模型大鼠后，MMP-9在異位子宮內(nèi)膜中的表達(dá)情況（×400）Fig.3 The expression of MMP-9 in ectopic endometrium of rat after treatment

3.3 免疫組化觀測(cè)VEGF和MMP-9累計(jì)光密度值的表達(dá) 結(jié)果見表1。

表1 各組間VEGF和MMP-9累計(jì)光密度值（IOD）的表達(dá) （±s）Tab.1 The relative IOD of endometrium（±s）

表1 各組間VEGF和MMP-9累計(jì)光密度值（IOD）的表達(dá) （±s）Tab.1 The relative IOD of endometrium（±s）

注：與模型組相比較，*P ＜0.05。Note：*P ＜0.05 vs model group.

組別 n VEGF MMP-9對(duì)照組 8 1.26 ±0.21* 1.58 ±0.44*模型組 10 189.38 ±11.52 131.08 ±27.00孕三烯酮組 10 11.63 ±5.73* 25.35 ±5.89*姜黃組 12 11.9 ±0.47* 0.69 ±0.12*

表1結(jié)果顯示：C組、D組與B組比較異位組織的 VEGF、MMP-9 的表達(dá)，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而C、D間比較無顯著性差異（P＞0.05）。

4 討論

EMS的形成，血管生存是其基本條件。VEGF是一種多肽類細(xì)胞因子，可直接作用于組織血管內(nèi)皮細(xì)胞，刺激內(nèi)皮細(xì)胞生長，導(dǎo)致新生血管的形成［8-9］。MMPs是一組蛋白水解酶，有破壞與降解細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的作用，MMP-9能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的出芽，導(dǎo)致新生血管的形成；侵犯基底膜細(xì)胞外基質(zhì)，并種植于腹膜［10-11］。VEGF和MMP-9是影響EMS的發(fā)生、發(fā)展過程重要因素，這一點(diǎn)也是學(xué)術(shù)界達(dá)成共識(shí)的。

因此本研究通過姜黃對(duì)EMS動(dòng)物模型的作用，以了解其治療機(jī)理。異位內(nèi)膜組織中VEGF、MMP-9的高表達(dá)，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)姜黃干預(yù)后其表達(dá)均顯著下降。各組與模型組相比肉眼、鏡下組織形態(tài)變化，VEGF、MMP-9表達(dá)情況有明顯差異，說明VEGF和MMP-9在EMS的發(fā)病及異位內(nèi)膜宮外轉(zhuǎn)移種植過程中具有重要作用，其表達(dá)下降從而降低異位內(nèi)膜的種植、侵襲能力。

EMS發(fā)病機(jī)理中醫(yī)認(rèn)為是“血瘀”所致，姜黃源于《新修本草》［12］，藥物性味辛、苦、溫。它辛溫行散，苦以開泄，歸肝、脾經(jīng)。有活血行氣，通經(jīng)止痛的功效，現(xiàn)代藥理研究，姜黃能抑制血小板聚集降低血黏度、抗炎、抗腫瘤等作用。因此它可減輕盆腔組織的黏連及瘀腫，使沖任通暢，EMS得到控制和恢復(fù)。研究VEGF、MMP-9及其在EMS中的表達(dá)調(diào)節(jié)，對(duì)尋找針對(duì)的中藥藥物，為治療EMS開辟新的治療途徑。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)姜黃干預(yù)后其 VEGF、MMP-9均明顯下降，具有抑制異位內(nèi)膜VEGF表達(dá)而達(dá)到抑制異位子宮內(nèi)膜生長，促進(jìn)其萎縮，說明姜黃可能是通過抑制VEGF、MMP-9等的調(diào)節(jié)，糾正機(jī)體的瘀血狀態(tài)，抑制異位血管生成，改善盆腔循環(huán)，而達(dá)到治療EMS的目的。

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Effect of Curcuma on expressions in endometriosis rats

CHEN Rong1， CHEN Jin-long2， FANG Yi1， ZHANG Qin-shu1， DUAN Hen1*

（1.Departement of Traditional Chinese Medicine，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China；2.The John Curtin School of Medical Reseach，The Australian National University，Canberra，Australia）

Curcuma；endometriosis；VEGF；MMP-9

R285.5

A

1001-1528（2011）07-1145-04

2011-01-11

重慶市自然科學(xué)基金（CSTC，2008BB5217）；教育部“春暉計(jì)劃”教外司留（2009）525號(hào)

陳 蓉（1963—），女，碩士，副教授，研究方向：婦科腫瘤、不孕癥。

*通信作者：段 恒（1977—），女，博士，研究方向：女性生殖健康。Tel：13512337203，E-mail：CR8093@126.com