利血康抗阿糖胞苷性血小板減少癥作用的實(shí)驗(yàn)研究

雷 紅， 王 毅， 蔡亮亮， 魏 偉

（1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽合肥230009；2.合肥恒星藥物研究所，安徽合肥 230051）

利血康抗阿糖胞苷性血小板減少癥作用的實(shí)驗(yàn)研究

雷 紅1， 王 毅1， 蔡亮亮1， 魏 偉2

（1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽合肥230009；2.合肥恒星藥物研究所，安徽合肥 230051）

目的 研究利血康顆粒（三七、白及、藕節(jié)等）抗小鼠阿糖胞苷性血小板減少癥模型的作用。方法 采用小鼠阿糖胞苷性血小板減少癥模型，同時(shí)灌服利血康顆粒 3 種劑量 2.25、1.13、0.56 g/kg（折合生藥 9、4.5、2.25 g/kg，ig）治療 8 d，觀察藥物對(duì)該動(dòng)物模型凝血時(shí)間、外周血血小板（Bpc）數(shù)、骨髓巨核細(xì)胞數(shù)和骨髓DNA的影響。結(jié)果 利血康顆粒高、中劑量可明顯縮短阿糖胞苷性血小板減少癥模型小鼠的凝血時(shí)間、升高外周血Bpc數(shù)、骨髓巨核細(xì)胞數(shù)和骨髓DNA。結(jié)論 利血康顆粒對(duì)小鼠阿糖胞苷性繼發(fā)性血小板減少癥模型具有拮抗作用，該作用與其促進(jìn)骨髓造血干細(xì)胞尤其是骨髓巨核細(xì)胞的分化增殖，減輕骨髓抑制有關(guān)。

利血康顆粒；阿糖胞苷；血小板減少癥

血小板減少癥是血液內(nèi)科的常見(jiàn)病，目前臨床用于治療血小板減少癥的藥物主要為腎上腺皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等。近年來(lái)越來(lái)越多的學(xué)者采用中醫(yī)藥或中西醫(yī)結(jié)合治療血小板減少癥。因此，根據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)理論，結(jié)合臨床應(yīng)用研究的成果，我們研制開(kāi)發(fā)了利血康顆粒。利血康顆粒由三七、白及、藕節(jié)炭等組成，臨床應(yīng)用多例療效良好。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)復(fù)制小鼠阿糖胞苷性血小板減少癥模型，觀察利血康顆粒對(duì)繼發(fā)性血小板減少癥的防治作用，為新藥研究及臨床應(yīng)用提供藥效學(xué)依據(jù)，并探討其升高血小板的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 昆明種小白鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)于安徽省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證：皖醫(yī)實(shí)動(dòng)準(zhǔn)字第03號(hào)。

1.2 藥物與試劑 利血康顆粒內(nèi)容物（干浸膏粉），合肥恒星藥物研究所提供，1 g干浸膏折合總生藥4 g。陽(yáng)性對(duì)照藥：血康口服液，主要成分為腫節(jié)風(fēng)等提取的黃酮苷、氰苷、延胡索酸、琥珀酸等，規(guī)格10 mL/支，江西天獅中藥集團(tuán)貴溪制藥廠(chǎng)。注射用鹽酸阿糖胞苷（Ara-C），規(guī)格50 mg/支，上海華聯(lián)制藥有限公司。其余試劑均為分析純。

1.3 儀器 高速冷凍離心機(jī)（Beckman，HJM6）；85081型倒置光學(xué)顯微鏡（重慶光學(xué)儀器廠(chǎng)）；EL301 Strip reader酶標(biāo)儀（美國(guó)BIO-TEK公司）；530紫外分光光度計(jì)（YLS-SOP-002，上海分析儀器廠(chǎng)）。

1.4 方法

1.4.1 小鼠阿糖胞苷性血小板減少癥模型［1-2］、分組與給藥 小鼠60只，隨機(jī)分為6組：正常對(duì)照組、模型組、利血康顆粒高、中、低3個(gè)劑量組（2.25、1.13、0.56 g 干浸膏/kg，折合 9、4.5、2.25 g 生藥/kg）、陽(yáng)性對(duì)照組，每組10只，雌雄各半。除正常對(duì)照組外，每組小鼠腹腔注射Ara-C 100 mg/（kg·d），連續(xù)2 d，第3天 ip Ara-C 50 mg/（kg·d），連續(xù)3 d。于注射同時(shí)每日灌胃給藥，正常和模型對(duì)照組灌胃等容積蒸餾水，連續(xù)給藥8 d。每日觀察動(dòng)物的一般狀況、活動(dòng)、感染、出血、攝食等。每周稱(chēng)體質(zhì)量2次，并以此來(lái)調(diào)整用藥量。陽(yáng)性對(duì)照組小鼠ig血康口服液稀釋液0.2 mL/kg。

1.4.2 凝血時(shí)間測(cè)定［3-4］于給藥前1 d與末次給藥1 h后毛細(xì)管眼眶取血，滴于載波片，血滴直徑約5 mm，立即用秒表記時(shí)。用清潔的4號(hào)注射針頭自血滴邊緣向里輕輕撥動(dòng)，觀察有無(wú)血絲挑起，從采血開(kāi)始至挑起血絲止即為凝血時(shí)間。

1.4.3 血細(xì)胞計(jì)數(shù) 剪尾采血，采用顯微鏡人工計(jì)數(shù)Bpc，嚴(yán)格按《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》中《血小板計(jì)數(shù)》的“目視計(jì)數(shù)法”操作［5］。于給藥前1 d與給藥結(jié)束后1 d進(jìn)行。以Bpc變化率表示結(jié)果：Bpc變化率=（給藥前Bpc數(shù)－給藥后Bpc數(shù)）/給藥前Bpc數(shù)×100%。

1.4.4 骨髓細(xì)胞涂片檢查 取一側(cè)完整股骨，除凈軟組織，剪去股骨兩端，取0.1 mL生理鹽水反復(fù)沖洗股骨腔，將沖洗液涂片（2 cm×2 cm），經(jīng)瑞氏染色，先在4×鏡下全片瀏覽，再在10×鏡下計(jì)數(shù)20個(gè)視野內(nèi)的巨核細(xì)胞數(shù)，報(bào)告每個(gè)視野（10×）巨核細(xì)胞的平均數(shù)。

1.4.5 骨髓DNA測(cè)定［6］取另一側(cè)完整股骨，除凈軟組織，用0.005 mol/L CaCl210 mL將全部骨髓沖入離心管中，4℃下靜置30 min，離心（2 500 r/min，15 min），棄上清液，沉淀物加 0.2 mol/L HClO45 mL充分混合，90℃水浴15 min，冷卻，過(guò)濾，濾液定容至15 mL，紫外分光光度計(jì)268 nm處測(cè)定吸光度A值。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)阿糖胞苷血小板減少癥小鼠凝血時(shí)間的影響 與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠凝血時(shí)間明顯延長(zhǎng)（P＜0.01）；利血康顆粒高、中劑量及血康口服液均可使凝血時(shí)間明顯縮短（P＜0.01或P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 利血康顆粒對(duì)阿糖胞苷血小板減少癥小鼠凝血時(shí)間（s）的影響 （±s，n=10）Tab.1 Effect of Lixuekang Granules on coagulation time of Ara-C-induced thrombocytopenia mice （ˉx ± s，n=10）

表1 利血康顆粒對(duì)阿糖胞苷血小板減少癥小鼠凝血時(shí)間（s）的影響 （±s，n=10）Tab.1 Effect of Lixuekang Granules on coagulation time of Ara-C-induced thrombocytopenia mice （ˉx ± s，n=10）

注：與正常組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01；與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01。Note：*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs normal group；#P ＜0.05，##P ＜0.01，vs model group.

組別 劑量 給藥前/s 給藥后/s正常對(duì)照 —110.79 ±33.92 116.46 ±41.67模型對(duì)照 — 121.32±40.63 257.68±53.46＊＊利血康顆粒 2.25 g干浸膏/kg 125.87 ±30.73 156.36 ±35.77*##1.13 g干浸膏/kg 117.65 ±32.71 181.28 ±43.81＊＊##0.56 g干浸膏/kg 120.49 ±41.23 216.72 ±45.83＊＊血康口服液 0.2 mL/10 g 109.27 ±28.31 182.39 ±51.62*#

2.2 對(duì)阿糖胞苷血小板減少癥小鼠外周血Bpc的影響 與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠外周血Bpc數(shù)明顯降低（P＜0.01）。利血康顆粒高、中劑量及血康口服液均可使減少的Bpc數(shù)明顯升高（P＜0.01或P＜0.05），見(jiàn)表2。

2.3 對(duì)阿糖胞苷血小板減少癥小鼠骨髓巨核細(xì)胞數(shù)的影響 與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠骨髓巨核細(xì)胞數(shù)明顯降低（P＜0.01）；利血康顆粒高劑量及血康口服液均可使降低的骨髓巨核細(xì)胞數(shù)明顯升高（P＜0.01），見(jiàn)表3。

2.4 對(duì)阿糖胞苷血小板減少癥小鼠骨髓DNA量的影響 與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠骨髓DNA量明顯降低（P＜0.01）；利血康顆粒高、中劑量可使降低的骨髓DNA量明顯升高（P＜0.01），見(jiàn)表4。

表2 利血康顆粒對(duì)阿糖胞苷血小板減少癥小鼠外周血Bpc的影響（±s，n=10）Tab.2 Effect of Lixuekang Granules on circulating platelet number of Ara-C-induced thrombocytopenia mice （ˉx ± s，n=10）

表2 利血康顆粒對(duì)阿糖胞苷血小板減少癥小鼠外周血Bpc的影響（±s，n=10）Tab.2 Effect of Lixuekang Granules on circulating platelet number of Ara-C-induced thrombocytopenia mice （ˉx ± s，n=10）

注：與正常組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01；與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01。Note：*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs normal group；#P ＜0.05，##P ＜0.01，vs model group.

組別 劑量 給藥前Bpc數(shù)/（×109/L） 給藥后Bpc數(shù)/（×109/L） Bpc變化率/%正常對(duì)照 —714.44 ±139.41 677.22 ±108.87 4.07 ±12.39模型對(duì)照 — 864.50±181.01 430.80±121.26＊＊ 49.85±12.59＊＊利血康顆粒 2.25 g干浸膏/kg 973.78 ±239.28 731.44 ±147.77## 23.08 ±14.00＊＊##1.13 g干浸膏/kg 824.89 ±217.33 557.56 ±146.00 30.59 ±16.54＊＊#0.56 g干浸膏/kg 762.10 ±239.74 483.50 ±210.33* 36.89 ±14.99＊＊血康口服液 0.2 mL/10 g 818.13 ±178.42 544.25 ±111.62* 32.34 ±14.46＊＊#

表3 利血康顆粒對(duì)阿糖胞苷血小板減少癥小鼠骨髓巨核細(xì)胞數(shù)的影響（±s，n=10）Tab.3 EffectofLixuekang Granuleson marrow megakaryocytes number of Ara-C-induced thrombocytopenia mice （ˉx ± s，n=10）

表3 利血康顆粒對(duì)阿糖胞苷血小板減少癥小鼠骨髓巨核細(xì)胞數(shù)的影響（±s，n=10）Tab.3 EffectofLixuekang Granuleson marrow megakaryocytes number of Ara-C-induced thrombocytopenia mice （ˉx ± s，n=10）

注：與正常組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01；與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01。Note：*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs normal group；#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs model group.

組別 劑量 骨髓巨核細(xì)胞數(shù)/（個(gè)/視野）正常對(duì)照 —1.08 ±0.38模型對(duì)照 — 0.31±0.09＊＊利血康顆粒 2.25 g干浸膏/kg 0.80 ±0.20##1.13 g干浸膏/kg 0.38 ±0.26＊＊0.56 g干浸膏/kg 0.34 ±0.09＊＊血康口服液 0.2 mL/10 g 0.80 ±0.30##

表4 利血康顆粒對(duì)阿糖胞苷血小板減少癥小鼠骨髓DNA的影響（±s，n=10）Tab.4 Effect of Lixuekang Granules on marrow DNA content of Ara-C-induced thrombocytopenia mice（ˉx ± s，n=10）

表4 利血康顆粒對(duì)阿糖胞苷血小板減少癥小鼠骨髓DNA的影響（±s，n=10）Tab.4 Effect of Lixuekang Granules on marrow DNA content of Ara-C-induced thrombocytopenia mice（ˉx ± s，n=10）

注：與正常組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01；與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01。Note：*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs normal group；#P ＜0.05，##P ＜0.01，vs model group.

組別 劑量 骨髓DNA量吸光度A值正常對(duì)照 —0.667 ±0.112模型對(duì)照 — 0.396±0.046＊＊利血康顆粒 2.25 g干浸膏/kg 0.546 ±0.107*##1.13 g干浸膏/kg 0.475 ±0.036＊＊##0.56 g干浸膏/kg 0.442 ±0.095＊＊血康口服液 0.2 mL/10 g 0.398 ±0.057＊＊

3 討論

血小板減少癥病因可為繼發(fā)性如化療藥物、放射治療引起，或原發(fā)性如特發(fā)性血小板減少性紫癜（ITP）等。化療藥物引起的血小板減少，多與其抑制骨髓造血干細(xì)胞，尤其是骨髓巨核細(xì)胞的分化增殖有關(guān)［7］。阿糖胞苷臨床上用于治療急性粒細(xì)胞白血病和腫瘤；其通過(guò)阻礙核酸代謝和DNA合成，抑制骨髓造血干細(xì)胞，引起血小板減少，故可用于造成繼發(fā)性血小板減少動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)研究［2］。

利血康顆粒是由三七、白及、藕節(jié)炭等組成的中成藥，來(lái)源于古方“安血飲”加減，功具活血化瘀，收斂止血之效，可用于瘀血內(nèi)阻之出血證。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)小鼠阿糖胞苷性血小板減少癥動(dòng)物模型，研究了利血康顆粒治療繼發(fā)性血小板減少癥的作用及其機(jī)理。結(jié)果表明，利血康顆?？擅黠@延長(zhǎng)阿糖胞苷性血小板減少癥模型小鼠的凝血時(shí)間、升高外周血血小板數(shù)，并可升高骨髓巨核細(xì)胞數(shù)和骨髓DNA量。說(shuō)明利血康顆粒對(duì)小鼠阿糖胞苷性血小板減少癥模型具有明顯的治療作用；其作用機(jī)理與其促進(jìn)骨髓造血干細(xì)胞，尤其是骨髓巨核細(xì)胞的分化增殖，減輕骨髓抑制有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)為利血康顆粒用于繼發(fā)性血小板減少癥的治療提供了藥效學(xué)依據(jù)。

［1］王安行，朱家谷.血康膠囊升血小板和白細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，1998，8（3）：144-145.

［2］徐國(guó)良，肖兵華，陳 奇，等.阿糖胞苷誘發(fā)小鼠血小板減少模型的研究［J］.中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2005，10（4）：387-390.

［3］陳 奇.中藥藥理研究方法學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1994：484-484.

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Experimental study on anti-cytarabine（Ara-C）-induced thrombocytopenia effect of Lixuekang Granules

LEI Hong1， WANG Yi1， CAI Liang-liang1， WEI Wei2
（1.College of Biological and Food Engineering，Hefei University of Technology，Hefei 230009，China；2.Hefei Hengxing Pharmaceutical Institute，Hefei 230051，China）

AIMTo explore the effect of Lixuekang Granules（Notoginseng Radix et Rhizoma，Bletillae Rhizoma，Nelumbinis Rhizomatis Nodus，etc）on mice model of cytarabine（Ara-C）-induced thrombocytopenia.METHODSAra-C-induced thrombocytopenia mice model was adopted.The model was intragastrically given three doses of Lixuekang Granules 2.25，1.13，0.56 g/kg（equivalent to 9，4.5，2.25 g/kg crude drugs）for eight days simultaneously.Coagulation time of mice，circulating platelet counting，marrow megakaryocytes counting and marrow DNA content were investigated.RESULTS2.25，1.13 g/kg of Lixuekang Granules could shorten the coagulation time，elevate circulating platelet counting，marrow megakaryocytes counting and marrow DNA content of Ara-C-induced thrombocytopenia mice markedly.CONCLUSIONLixuekang Granules have the effect of anti-secondary thrombocytopenia induced by Ara-C，which may be related to its promoting differentiation and proliferation of marrow hemopoietic stem cells，especially marrow megakaryocytes and alleviating marrow inhibitory effect.

Lixuekang Granules；cytarabine（Ara-C）；thrombocytopenia

R285.5

A

1001-1528（2011）07-1113-03

2010-07-21

雷 紅（1973—），女，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向：天然產(chǎn)物純化與作用機(jī)理。E-mail：leihong66@sohu.com