百蕊草藥材的指紋圖譜研究

湯 超， 許伏新， 徐國(guó)兵， 韓玲玲， 方成武， 劉守金， 梁益敏

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽合肥230032；2.安徽省食品藥品監(jiān)督管理局，安徽 合肥230023；3.安徽省食品藥品檢驗(yàn)所，安徽合肥230051；4.安徽中醫(yī)學(xué)院，安徽合肥 230038）

百蕊草藥材的指紋圖譜研究

湯 超1， 許伏新2*， 徐國(guó)兵3， 韓玲玲3， 方成武4， 劉守金4， 梁益敏4

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽合肥230032；2.安徽省食品藥品監(jiān)督管理局，安徽 合肥230023；3.安徽省食品藥品檢驗(yàn)所，安徽合肥230051；4.安徽中醫(yī)學(xué)院，安徽合肥 230038）

目的 采用高效液相色譜法建立來自14個(gè)不同產(chǎn)地的15批百蕊草樣品的指紋圖譜。方法 甲醇加熱回流提取1 h獲得百蕊草提取液，采用HPLC分析百蕊草的指紋圖譜。色譜柱Inertsil OSD-SP（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相甲醇-0.4%磷酸水溶液梯度洗脫；分析時(shí)間75 min；檢測(cè)波長(zhǎng)365 nm；柱溫30℃；體積流量0.8 mL/min。結(jié)果 建立了百蕊草的指紋圖譜，5號(hào)山柰素峰為對(duì)照峰，確定了8個(gè)共有峰。結(jié)論 該指紋圖譜方法簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性好，可作為百蕊草藥材質(zhì)量控制的重要方法。

百蕊草；高效液相色譜；指紋圖譜

百蕊草Thesium chineseTurcz.為檀香科Santalaceae植物百蕊草的干燥全草，其性味平緩、微苦、澀、寒，具有清熱解毒、消腫之功能。臨床上多用于治療急性乳腺炎、肺炎、扁桃體炎、咽喉炎、癤腫等病癥［1-2］?，F(xiàn)代藥理研究表明：百蕊草具有顯著的抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛和抗菌作用，其所含的黃酮類化合物為其抗菌的有效成分［3-6］。目前對(duì)百蕊草藥材的質(zhì)量控制方法主要是總黃酮的測(cè)定［7］，以及山柰素的薄層鑒別和測(cè)定［8-9］等，為更有效的控制其質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用梯度洗脫法建立了百蕊草的HPLC指紋圖譜的分析方法，對(duì)安徽省各主要百蕊草產(chǎn)地所產(chǎn)藥材進(jìn)行比較性的研究，并以百蕊草藥材對(duì)照?qǐng)D譜與湖北省采集的百蕊草藥材指紋圖譜進(jìn)行了對(duì)比研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-20AT高效液相色譜儀（DAD檢測(cè)器，島津LC solution色譜工作站）；色譜柱為Inertsil OSD-SP（4.6 mm ×150 mm，5 μm）；國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（版本2004）；Mettler AE-240型電子天平（萬分之一，瑞士Mettler）；超聲清洗機(jī)（美國(guó) Elmasonic）。

1.2 試藥 山柰素對(duì)照品（批號(hào)：110861-200808）購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；甲醇（色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；水為自制重蒸水；其它試劑均為分析純。

1.3 百蕊草藥材 各百蕊草藥材樣品具體來源見表1，經(jīng)安徽中醫(yī)學(xué)院劉守金教授鑒定為檀香科植物百蕊草Thesium chineseTurcz.。

表1 樣品來源Tab.1 Sources of sample

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備 稱取0.5 g的百蕊草藥材粉末（過80目篩），精密稱定，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液15 mL，置平底燒瓶中，精密加入50%鹽酸5 mL，搖勻，置水浴中加熱水解30 min，立即冷卻，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取山柰素對(duì)照0.5 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，0.45 μL 微孔濾膜濾過，即得。

2.3 色譜條件 色譜柱：Inertsil OSD-SP（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A 相）-0.4%磷酸水溶液（B相），梯度洗脫條件：B 0～40 min（80% ～60%）；40～70 min（60%）；70～75 min（60%～80%）；體積流量：0.8 mL/min，柱溫：30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：365 nm，分析時(shí)間：75 min，進(jìn)樣量：20 μL。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度實(shí)驗(yàn) 取同一樣品，按供試品溶液的制備方法制備，連續(xù)進(jìn)樣5次，檢測(cè)指紋圖譜。各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于2%，相對(duì)峰面積RSD均小于5%。

2.4.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品5份，按供試品溶液的制備方法制備，連續(xù)進(jìn)樣進(jìn)行分析。各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于2%，相對(duì)峰面積RSD均小于5%。

2.4.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一樣品，按供試品溶液的制備方法制備，分別于 0、2、4、8、24 h 進(jìn)樣 5 次，考察色譜峰相對(duì)峰面積的一致性。各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于2%，相對(duì)峰面積RSD均小于5%，結(jié)果表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 樣品指紋圖譜分析及結(jié)果

2.5.1 不同產(chǎn)地百蕊草藥材指紋圖譜的建立 取各百蕊草藥材，按2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取20μL注入液相色譜儀，按2.3項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，根據(jù)測(cè)定結(jié)果，制定以山柰素為參照物的指紋譜圖。對(duì)照品圖譜見圖1，百蕊草不同產(chǎn)地指紋圖譜見圖2。

圖1 對(duì)照品溶液HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of reference substances

2.5.2 百蕊草藥材共有指紋峰的建立 通過“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（版本2004）軟件對(duì)安徽的13批藥材的色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，經(jīng)過比對(duì)，將時(shí)間窗寬度設(shè)為0.5，選擇山柰素的色譜峰進(jìn)行校正及自動(dòng)匹配，以中位數(shù)法生成百蕊草共有模式指紋圖譜（見圖3）。13批樣品有8個(gè)共有峰，其中5號(hào)峰為山奈素。以3號(hào)色譜峰（保留時(shí)間為41.209 min）作為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，具體數(shù)據(jù)見表2、表3。各樣品出峰總數(shù)占總峰面積百分比見表4。

圖2 百蕊草HPLC色譜圖Fig.2 Fingerprint of Thesinm Chinese Turcz.from Anhui province

圖3 共有模式圖Fig.3 Common pattern

表2 各樣品共有峰相對(duì)保留時(shí)間Tab.2 Relative retention time of common peaks for various samples

表3 各樣品共有峰相對(duì)峰面積Tab.3 Relative areas of common peaks for various samples

表4 各樣品共有峰面積Tab.4 Common peak area for various sample

2.5.3 百蕊草藥材相似度評(píng)價(jià) 通過“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（版本2004）對(duì)安徽13批百蕊草藥材的色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，以共有峰為對(duì)照模板，計(jì)算各色譜圖整體的相似度，具體數(shù)據(jù)見表5。

2.5.4 對(duì)其它產(chǎn)地百蕊草藥材進(jìn)行的評(píng)價(jià) 在相似度計(jì)算軟件中以百蕊草藥材的共有模式圖為參照?qǐng)D譜，導(dǎo)入湖北省采集的1年生和2年生藥材各1批的指紋圖譜，以對(duì)照品色譜峰進(jìn)行校正，自動(dòng)匹配后計(jì)算相似度，結(jié)果兩批藥材相似度分別為0.974、0.914。

3 討論

3.1 流動(dòng)相及波長(zhǎng)的選擇 實(shí)驗(yàn)研究過程中，通過考察甲醇-水、甲醇-0.4%磷酸水、乙腈-水、乙腈-0.4%磷酸水溶液等多種流動(dòng)相體系，通過比較，以甲醇-0.4%磷酸水溶液系統(tǒng)洗脫可使色譜峰出峰較好，故選用該流動(dòng)相系統(tǒng)。本實(shí)驗(yàn)前期階段結(jié)合了190～400 nm波段的三維掃描圖，對(duì)HPLC-DAD色譜圖進(jìn)行分析，選擇指標(biāo)成分山柰素和其它成分紫外吸收相對(duì)均較強(qiáng)的波長(zhǎng)，結(jié)果在365 nm處山柰素的吸收較強(qiáng)，且色譜圖各色譜峰信號(hào)較豐富，所以選定365 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

表5 樣品相似度Tab.5 Similarity of samples

3.2 樣品提取條件的篩選 對(duì)百蕊草藥材提取方法進(jìn)行研究時(shí)，試驗(yàn)了不同提取溶劑［10］（95%乙醇、50%乙醇、30%乙醇、50%甲醇、甲醇），以及超聲提取、回流提取、索氏提取等不同提取方式，同時(shí)還考察了不同提取時(shí)間的提取效果［11-12］。通過一系列的實(shí)驗(yàn)表明，用甲醇回流提取1 h提取液的成分最多，信息量最豐富，因此選用甲醇回流提取1 h的方法進(jìn)行提取。

3.3 百蕊草指紋圖譜的相似度分析 采用了HPLC法對(duì)百蕊草藥材甲醇提取物進(jìn)行分析，各樣品HPLC指紋圖譜雖存在一定差異，但均具有相同的色譜特征峰；除安徽滁州三批藥材相似度評(píng)價(jià)結(jié)果小于0.9外，安徽其它產(chǎn)地10批樣品相似度均大于0.9，說明本研究所得的百蕊草色譜指紋圖譜共有模式具有較強(qiáng)的專屬性。

應(yīng)用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（版本2004）對(duì)滁州三批進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，相似度分別為0.959，0.990，0.972，說明滁州產(chǎn)百蕊草藥材與安徽其它產(chǎn)地的百蕊草藥材質(zhì)量存在一定的差異。

在指紋圖譜相似度大于0.9的藥材色譜圖上，各峰的歸一化峰面積結(jié)果表明，不同產(chǎn)地百蕊草藥材主要成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)仍然存在明顯差異，建議在色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)上，結(jié)合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的鑒別、檢查、浸出物、主成分定量測(cè)定等項(xiàng)目，進(jìn)行百蕊草藥材的綜合評(píng)價(jià)，以保證臨床用藥的安全有效。

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HPLC fingerprint of Thesium chinese Turcz.

TANG Chao1， XU Fu-xin2*， XU Guo-bing3， HAN Ling-ling3， FANG Cheng-wu4， LIU Shou-jin4，LIANG Yi-min4

（1.College of Pharmaceutical Sciences，Anhui Medical University，Hefei 230032，China；2.Anhui Provincial Food and Drug Administration，Hefei 230023，China；3.Anhui Institute for Food and Drug Control，Hefei 230051，China；4.Anhui College of Traditional Chinese Medicine，Hefei 230038，China）

AIMTo establish chromatographic fingerprints of fifteen batches ofThesium chineseTurcz.from fourteen different habitats by HPLC.METHODSThe extract ofThesium chineseTurcz.was obtained with methyl hydrate by thermal reflux for an hour.Analysis was performed on Inertsil OSD-SP column（4.6 mm ×150 mm，5 μm）with gradient mobile phase of methanol-0.4%H3PO4.The fingerprint finished in 75 min，the detection wavelength was at 365 nm and the column temperature was 30 ℃ with the flow rate of 0.8 mL/min.RESULTSEstablishing the fingerprints ofThesium chineseTurcz.，marker peak was kaempferide（No.5 peak），eight common peaks were found in the HPLC fingerprints from different habitats.CONCLUSIONThe method is simple，accurate，with good reproducibility，and it can be used specifically for the quality control ofThesium ChineseTurcz.

Thesium chineseTurcz.；fingerprint；HPLC

R284.1

A

1001-1528（2011）07-1102-04

2010-08-31

國(guó)家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究專項(xiàng)（06-07ZP25）；安徽省學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人及后備人選科研活動(dòng)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目（2009年）

湯 超（1986—），男，碩士生。Tel：13966766557，E-mail：tiankong611@yahoo.com.cn

* 通信作者：許伏新（1968—），男，碩士，從事藥事管理研究。Tel：（0551）2999221，E-mail：fuxin@ada.gov.cn