宮血寧膠囊HPLC指紋圖譜研究

何 佳， 李 懿， 韋建榮

（云南白藥集團(tuán)股份有限公司，云南昆明 650032）

宮血寧膠囊HPLC指紋圖譜研究

何 佳， 李 懿， 韋建榮*

（云南白藥集團(tuán)股份有限公司，云南昆明 650032）

目的 本研究建立宮血寧膠囊（重樓）的HPLC指紋圖譜分析方法，為宮血寧膠囊內(nèi)在質(zhì)量評(píng)價(jià)積累數(shù)據(jù)。方法

采用 RP-HPLC 方法，以 Agilent Series SB-AQ C18色譜柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-水（B），梯度洗脫程序?yàn)?～50 min，20% ～42%A；50～70 min，42% ～44%A；70～100 min，44% ～80%A；100～120 min，80% ～95%A；洗脫時(shí)間為120 min；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm；體積流量1.0 mL/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量10 μL，進(jìn)行指紋圖譜研究。結(jié)果 建立宮血寧膠囊指紋圖譜，以重樓皂苷H色譜峰為參照峰，確定12個(gè)共有峰，測(cè)定了60批樣品，樣品指紋圖譜相似度均大于0.99。結(jié)論 本法操作簡(jiǎn)便、分離效果好、穩(wěn)定性高、重現(xiàn)性好，可應(yīng)用于宮血寧膠囊的質(zhì)量控制及真?zhèn)纹疯b別。

宮血寧膠囊；高效液相色譜；指紋圖譜

宮血寧膠囊為硬膠囊劑，內(nèi)容物為淺黃棕色至灰棕色的粉末。其原料為重樓，重樓具有清熱解毒、消腫止痛、平喘止咳、涼肝定驚之功效，多用于疔瘡癰腫、咽喉腫痛、蟲蛇咬傷、跌打傷痛等癥［1-2］。宮血寧膠囊味苦。具有涼血止血，清熱除濕，化瘀止痛之功效。臨床上主要用于崩漏下血，月經(jīng)過(guò)多，產(chǎn)后或流產(chǎn)后宮縮不良出血、子宮功能性出血屬血液妄行癥者，及慢性盆腔炎之濕熱瘀結(jié)所致的少腹痛，腰痛，帶下增多等癥狀［1］?，F(xiàn)代化學(xué)研究表明，重樓屬植物主要活性成分為甾體皂苷類，約占總化合物數(shù)目的80%，其苷元主要為異螺甾烷醇類的薯蕷皂苷元和偏諾皂苷元［3-6］。

中藥指紋圖譜的建立及結(jié)合指標(biāo)成分的定量研究，是為了解決藥品質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)、監(jiān)督這一關(guān)鍵問(wèn)題，尋求一種新的方法和手段，是一個(gè)嶄新的課題和研究模式。針對(duì)藥材的生產(chǎn)、加工、貯存及制劑的原料、中間體、成品、流通產(chǎn)品等各環(huán)節(jié)進(jìn)行樣品分析，通過(guò)相似性和相關(guān)性的對(duì)比，目的在于全面控制中藥藥品的質(zhì)量命脈［7-13］。

宮血寧膠囊自上市以來(lái)，廣泛應(yīng)用于婦科、產(chǎn)科、計(jì)生科出血性疾病及（亞急性）慢性盆腔炎等疾病的防治。本實(shí)驗(yàn)按照國(guó)家藥品監(jiān)督管理局對(duì)中藥材及中成藥指紋圖譜研究的技術(shù)要求，根據(jù)宮血寧膠囊主要成分的性質(zhì)，采用高效液相色譜分析方法，測(cè)定了60批樣品，建立了宮血寧的HPLC指紋圖譜，利用HPLC指紋圖譜技術(shù)對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)量信息進(jìn)行監(jiān)控及真?zhèn)纹疯b別，為產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)累積資料，收集產(chǎn)品的均一性和穩(wěn)定性數(shù)據(jù)，確保產(chǎn)品的內(nèi)在質(zhì)量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑 高效液相色譜儀（Agilent 1100），自動(dòng)進(jìn)樣器，DAD檢測(cè)器；乙腈為色譜純，水為三蒸水，其它試劑均為分析純；重樓皂苷H，購(gòu)于中科院昆明植物研究所；宮血寧膠囊（云南白藥集團(tuán)股份有限公司）。

1.2 對(duì)照品溶液制備 取重樓皂苷H對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成0.4 mg/mL的對(duì)照品溶液。

1.3 供試品溶液制備 取本品20粒的內(nèi)容物，精密稱定，研細(xì)，取約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，以0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取濾液，作為供試品溶液。

1.4 色譜條件 Agilent Series SB-AQ C18色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫程序：5～50 min，20% ～42%A；50～70 min，42% ～44%A；70～100 min，44% ～80%A；100～120 min，80% ～95%A，洗脫時(shí)間120 min，檢測(cè)波長(zhǎng) 203 nm；體積流量1.0 mL/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 將宮血寧膠囊（批號(hào)20080306）供試品溶液進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖（見(jiàn)圖1），樣品出峰總數(shù)為21個(gè)，達(dá)到分離度要求的色譜峰數(shù)為15個(gè)，對(duì)比保留時(shí)間確定樣品中tR=56.3 min峰（8號(hào)峰）為重樓皂苷H色譜峰，重樓皂苷H與相鄰峰分離良好且保留時(shí)間適中，選作參照峰（S），確定12個(gè)共有峰，共有峰數(shù)占總峰數(shù)比例57%；計(jì)算各樣品中非共有峰占總峰面積的比值，結(jié)果表明，其比值均小于5%。2 h空針色譜圖和2 h樣品供試液圖表明檢測(cè)系統(tǒng)無(wú)其他干擾峰出現(xiàn)，組分在90 min內(nèi)出峰完全。

圖1 宮血寧膠囊（批號(hào)20080306）HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of Gongxuening Capsules

2.2 精密度試驗(yàn) 取同一批供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，考察各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積比值的一致性，結(jié)果顯示各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.35% ～2.97%，相對(duì)峰面積比值的RSD為0.82% ～2.64%，結(jié)果表明方法精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12、24、30、36、40、48 h 進(jìn)樣分析，考察各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積比值的一致性，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間 RSD為0.44% ～3.01%，相對(duì)峰面積比值的 RSD為 0.71% ～2.97%，結(jié)果表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批的供試品，分別制備供試品溶液6份，進(jìn)樣分析，考察各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積比值的一致性，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.31% ～2.94%，相對(duì)峰面積比值的RSD為0.88% ～2.72%，結(jié)果表明方法重現(xiàn)性良好。

2.5 指紋圖譜的建立及相似度分析

2.5.1 測(cè)定了連續(xù)5年的60批宮血寧膠囊，建立指紋圖譜。通過(guò)參照峰計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及RSD，得到各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于3.0%，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.5.2 相似度是評(píng)價(jià)中藥指紋圖譜一個(gè)最常用的參數(shù)，通常利用指紋圖譜的相似度數(shù)據(jù)來(lái)研究中藥質(zhì)量是否可控、穩(wěn)定。本研究采用《中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版》軟件來(lái)評(píng)價(jià)相似度，通過(guò)與系統(tǒng)建立共有模式比較，得到各批樣品的相似度數(shù)據(jù)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 60批宮血寧膠囊共有峰的相對(duì)保留時(shí)間Tab.1 The relative retention time of common peaks of 60 batches of samples

續(xù)表1

表2 60批宮血寧膠囊指紋圖譜相似度數(shù)據(jù)Tab.2 Similarity data of Gongxuening Capsules by HPLC fingerprint

3 討論

3.1 樣品處理?xiàng)l件的選擇 比較了甲醇、乙醇（分別為30%，50%，60%，70%，100%）共10種提取溶劑對(duì)樣品的提取率。結(jié)果顯示，提取率：無(wú)水甲醇＞無(wú)水乙醇＞含水甲醇＞含水乙醇，確定提取溶劑為無(wú)水甲醇。

3.2 流動(dòng)相系統(tǒng)的選擇 比較了乙腈-水的多種不同梯度洗脫溶劑系統(tǒng)。結(jié)果顯示，流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫程序?yàn)椋?～50 min，20% ～42%A；50～70 min，42% ～44%A；70～100 min，44% ～80%A；100～120 min，80% ～95%A，洗脫時(shí)間120 min，該梯度洗脫溶劑系統(tǒng)所得圖譜的峰型和分離度較好，故確定該梯度洗脫溶劑系統(tǒng)為流動(dòng)相系統(tǒng)。

3.3 本研究建立的宮血寧膠囊指紋圖譜分析方法，方法可靠，精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性良好，指紋圖譜具有一定的特征性，能反映宮血寧膠囊的特征，可用于宮血寧膠囊的質(zhì)量控制及真?zhèn)纹疯b別。

3.4 利用本方法對(duì)不同批次的宮血寧膠囊進(jìn)行指紋圖譜研究的結(jié)果顯示，連續(xù)5年的60批膠囊指紋圖譜相似度較高，從指紋圖譜共有峰的峰位和峰型看，分離效果好，同時(shí)也在一定程度上反映了宮血寧膠囊安全穩(wěn)定、質(zhì)量可靠的產(chǎn)品品質(zhì)。

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HPLC fingerprint of Gongxuening Capsules

HE Jia， LI Yi， WEI Jian-rong*
（Yunnan Baiyao Group Co.，Ltd，Kunming 650032，China）

AIMTo establish the HPLC fingerprint of Gongxuening Capsules（Paris polyphyllaSmith var.yunnanensis（Franch.）Hand.-Mazz）and accumulate data for evaluation of its quality.METHODSThe chromatographic fingerprints were determined with reversed-phase HPLC on an Agilent Series SB-AQ C18（4.6 mm ×250 mm，5 μm）with the gradient solvent system consisting of acetonitrile（A）and water（B），5－50 min，20% －42%A；50－70 min，42% －44%A；70－100 min，44% －80%A；100－120 min，80% －95%A，The flow rate was 1 mL/min，the detection wavelength was set at 203 nm，and the column temperature was maintained at 30℃.To deal with the data by“similarity of software of Chinese traditional medicine fingerprints”.RESULTSBased on the peaks of paris saponin H as reference peaks，measured value of sixty batches revealed that there were twelve common peaks and high similarity between samples of fingerprints.CONCLUSIONThis method is easy to handle and has good separation effect，reproducibility and high stability，and can be applied to quality control and product identifieation of Gongxuening Capsules.

Gongxuening Capsules；HPLC；fingerprints

R944.5

A

1001-1528（2011）07-1098-04

2010-10-28

何 佳（1980—），女，工程師，主要從事中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化控制與研究工作。Tel：（0871）4121231，E-mail：armor118@sina.com

*通信作者：韋建榮，男，碩士，正高級(jí)工程師，Tel：（0871）8324130，E-mail：jrwei@126.com