同科植物SSR引物在煙草遺傳差異分析中的應(yīng)用研究

聶 瓊，劉仁祥

（貴州大學(xué)煙草科學(xué)研究中心，貴陽(yáng) 550025）

分子標(biāo)記為研究作物遺傳多樣性及其品種改良提供了新的手段。在作物分子標(biāo)記及其應(yīng)用研究中，目前主要有RFLP、RAPD、SSR、SRAP、ISSR和AFLP標(biāo)記等，這些都有效提高了作物遺傳分析的效率和準(zhǔn)確性。SSR是指由幾個(gè)（多為2～4個(gè)）堿基組成的串聯(lián)重復(fù)的 DNA序列，如(CA)n，(ATG)n， (TAGG)n等重復(fù)。其長(zhǎng)度一般較短，廣泛分布于基因組的不同位置。不同遺傳材料重復(fù)次數(shù)的可變性導(dǎo)致了SSR長(zhǎng)度的高度變異性。由于其操作簡(jiǎn)單、多態(tài)含量豐富、遺傳信息量大、共顯性及檢測(cè)方便等特點(diǎn)，被認(rèn)為是一種理想的遺傳標(biāo)記，已廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位和分子標(biāo)記輔助育種等研究領(lǐng)域。目前，在水稻、玉米、番茄、小麥、擬南芥、辣椒等植物中應(yīng)用較多。煙草是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，也在科學(xué)研究中廣泛應(yīng)用，但是SSR標(biāo)記在煙草上的應(yīng)用，國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少。這是因?yàn)镾SR標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用的前提是特異物種的SSR引物的設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)，其開(kāi)發(fā)有一定難度，費(fèi)用也較高，因此限制了SSR標(biāo)記在煙草遺傳分析上的發(fā)展。針對(duì)煙草的SSR標(biāo)記引物開(kāi)發(fā)工作，直到2007年初，Bindler等進(jìn)行了首次報(bào)道[1]，目前國(guó)內(nèi)此類報(bào)道還較少。

本研究將同科植物的SSR引物應(yīng)用于煙草，同時(shí)對(duì)其在煙草品種資源中的應(yīng)用進(jìn)行探討，這對(duì)于加速煙草種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究利用、豐富其分子標(biāo)記類型與繪制遺傳圖譜具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

用于篩選引物的煙草材料14份（表1），包括烤煙、雪茄煙、白肋煙、曬晾煙、香料煙和野生種。用于遺傳多樣性分析的烤煙品種（系）24份（表2）。

表1 供試材料Table1 The test materials

1.2 方法

1.2.1 煙草基因組 DNA 提取 采用 CTAB 高鹽沉淀法[2]。

1.2.2 SSR標(biāo)記分析 擴(kuò)增反應(yīng)在 Eppendorf-PC5331型PCR儀上進(jìn)行，采用10 μL體系進(jìn)行擴(kuò)增，其中含10 ng模板DNA，2×Taq PCR MasterMix 5 μL（北京 TIANGEN），引物濃度為 0.5 μmol/L。擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性94 ℃ 4 min，94 ℃變性40 s，56 ℃退火40 s（退火溫度根據(jù)引物調(diào)整），72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，最終72 ℃ 延伸7 min。SSR引物序列（表3）選自文獻(xiàn)[3-4]，由上海生物工程有限公司合成。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染檢測(cè)。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 SSR 擴(kuò)增帶形以0和1統(tǒng)計(jì)，建立數(shù)據(jù)庫(kù)。在相同遷移率位置上，有帶記為 1，無(wú)帶記為0。計(jì)算引物多態(tài)信息量（PIC），PIC= 1-ΣPi2，Pi表示第i個(gè)等位位點(diǎn)出現(xiàn)的頻率。按Nei等（1979）的方法[5]計(jì)算任意兩個(gè)品種的相似系數(shù)（GS）：GS=2Nij(Ni+Nj)，其中，Ni和 Nj分別為 i和j兩份材料總的等位基因數(shù)，Nij為i和j兩材料的共有等位基因數(shù)，遺傳相異系數(shù)（GD）=1-GS，利用DPS 軟件，采用GD值按不加權(quán)成對(duì)群算數(shù)平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建分子進(jìn)化系統(tǒng)樹(shù)狀圖。

2 結(jié) 果

2.1 引物篩選

選取 5個(gè)類型 14個(gè)遺傳差異大的煙草材料DNA為模板，從22對(duì)SSR引物中篩選到多態(tài)性、重復(fù)性、穩(wěn)定性都較好的8對(duì)引物，引物多態(tài)性見(jiàn)表4。其中9號(hào)引物的電泳譜帶清晰可見(jiàn)，且不同品種的條帶不同，多態(tài)性為 100%（圖1）。8對(duì)引物共檢測(cè)到72條譜帶，60條遺傳多態(tài)性帶，多態(tài)性條帶數(shù)比率達(dá)83.33%，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為80～500 bp，每對(duì)引物擴(kuò)增的多態(tài)性帶數(shù)目為4～14個(gè)，平均7.5條；引物多態(tài)信息量變化范圍為0.714～1，平均 0.811。這表明，這些引物在檢測(cè)煙草基因組遺傳多態(tài)性上有較顯著的檢出效率，可以用于煙草SSR圖譜的檢測(cè)，并可進(jìn)行煙草遺傳多樣性分析和指紋圖譜的構(gòu)建。

表2 供試材料編號(hào)、 名稱及來(lái)源Table2 Code, name and origins of tobacco germplasms

表3 SSR 引物編號(hào)、序列及來(lái)源Table3 SSR primers’ codes, sequences and origins

2.2 SSR引物對(duì)烤煙品種（系）遺傳多態(tài)性分析

應(yīng)用篩選出的8對(duì)引物對(duì)24份烤煙品種（系）進(jìn)行SSR擴(kuò)增，8對(duì)引物共檢測(cè)到98個(gè)位點(diǎn)，其中 66個(gè)具有遺傳多態(tài)性，每對(duì)引物擴(kuò)增的多態(tài)性帶數(shù)目為5～16個(gè)，平均8.2個(gè)，引物多態(tài)信息量變化范圍為 0.451～1，平均 0.646。擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為50～560 bp。24個(gè)煙草材料的DNA譜帶表現(xiàn)出較好的遺傳多態(tài)性，圖2是引物9對(duì)24個(gè)烤煙材料的SSR圖譜，譜帶可把24個(gè)品種完全區(qū)分開(kāi)，表現(xiàn)出100%的多態(tài)性。

表4 多態(tài)性引物Table4 The primers which produced polymorphic bands

圖1 14個(gè)煙草材料DNA-SSR 指紋圖譜。1-14：引物9的擴(kuò)增圖譜；16-29：引物14的擴(kuò)增圖譜；M：MarkerFig.1 Result of PCR amplification using primers 9 and 14

圖2 引物9 對(duì)24 份煙草材料的SSR 擴(kuò)增圖譜。M：Marker，1～24為材料編號(hào)，其對(duì)應(yīng)的品種名稱同表2Fig.2 SSR patterns of 24 tobacco amplified by primer 9

2.3 品種（系）間親緣關(guān)系和聚類分析

根據(jù)8對(duì)引物的SSR圖譜，建立0-1數(shù)據(jù)庫(kù)，計(jì)算24個(gè)供試材料樣本間的遺傳相異系數(shù)（GD）。結(jié)果表明，遺傳相異系數(shù)變異范圍為 0.3445～0.8626，平均 0.6052，其中紅花大金元和威寧白花煙的遺傳相異系數(shù)最小，僅為0.3445，表明兩者的親緣關(guān)系最近。NC82和韭菜坪2號(hào)之間的遺傳相異系數(shù)最大（0.8626），表明它們相互之間的遺傳基礎(chǔ)相對(duì)較遠(yuǎn)。整體來(lái)看，引進(jìn)品種的遺傳相異系數(shù)0.6057略低于貴州選育品種（系）0.6236，表明我省地方材料品種的遺傳差異較大。本中心自選品系GDH系列的遺傳相異系數(shù)較近，為0.5640。在所有供試材料中，Va116與其他品種的遺傳相異系數(shù)最高，遺傳相異系數(shù)在0.484～0.717之間，說(shuō)明此品種與其他供試材料間遺傳基礎(chǔ)相對(duì)較大，遺傳相似性最低。

利用SSR遺傳距離矩陣按UPGMA方法構(gòu)建了各個(gè)供試品種的樹(shù)狀聚類圖（圖3）。聚類結(jié)果與品種間的親緣關(guān)系具有較好的一致性：在遺傳距離為0.63水平時(shí)，可將24個(gè)品種聚為4個(gè)類群，大部分美國(guó)引進(jìn)品種和本中心自育的品系都在第Ⅰ類；Coker147和Va116獨(dú)自成第Ⅱ和第Ⅳ類；貴州自育或地方品種及云煙 317，NC27NF等部分引進(jìn)品種歸為第Ⅲ類。在遺傳距離為0.54水平時(shí)，第Ⅰ類又可分為3個(gè)亞類，第Ⅰ亞類包括G70、GDH黃葉突變體、RG11、G80、C1-5-1、GDH84、GDH64，其中本中心自育的品系GDH84、GDH64、GDH黃葉突變體和G70、G80都有G28的血統(tǒng)，因此聚為一類。NC82自成第Ⅱ亞類，第Ⅲ亞類包括GDH02、K326、8611、GDH279、水城煙、K730，其中 GDH02、GDH279都具有8611的血統(tǒng)，而8611是中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所用（單育2號(hào)×G-28）×（G-28×凈葉黃）雜交育成的，也是G28的后代。第Ⅲ類又分為4個(gè)亞類。GDH88，NC27NF各自成為第Ⅰ亞類和第Ⅳ亞類，第Ⅱ亞類包括紅花大金元、威寧白花煙、南江3號(hào)、G140，其中南江3號(hào)是從紅花大金元品種中獲得的自然變異株，經(jīng)系統(tǒng)選擇培育而成。第Ⅲ亞類包括韭菜坪2號(hào)和云煙317。系譜分析表明，多數(shù)品種的親緣關(guān)系與聚類結(jié)果基本一致，少數(shù)不一致，這可能與其長(zhǎng)期定向栽培選育過(guò)程中產(chǎn)生變異有關(guān)。

3 討 論

圖3 24 份煙草材料基于SSR 標(biāo)記的聚類圖Fig.3 Clustering of 24 tobacco materials based on SSR

一些研究人員早已證明一個(gè)物種的微衛(wèi)星引物可以在研究其近源植物中被利用[5-6]。筆者運(yùn)用番茄、辣椒的SSR引物對(duì)24份在煙草育種中貢獻(xiàn)較大的種質(zhì)進(jìn)行SSR擴(kuò)增分析，結(jié)果表明遺傳相異系數(shù)變異范圍在0.3445～0.8626之間，平均0.6052，說(shuō)明這些品種（系）之間的遺傳背景較遠(yuǎn)。聚類分析結(jié)果也從分子水平進(jìn)一步驗(yàn)證了我國(guó)煙草育種資源的匱乏，主要使用的主體親本是 K326、紅花大金元和 G28。梁景霞[8]、肖炳光[9]、陶愛(ài)芬等[10]分別運(yùn)用ISSR、RAPD、AFLP、SRAP、SSR等標(biāo)記對(duì)現(xiàn)有主要育成品種和栽培煙草品種的遺傳多樣性及系譜親緣關(guān)系進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)品種之間的遺傳背景相似，親緣關(guān)系較近，特別是烤煙品種之間存在著遺傳基礎(chǔ)狹窄的問(wèn)題。與前人的研究結(jié)果相比，筆者發(fā)現(xiàn)本研究的這些烤煙品種（系）間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，這與這些材料是本中心雜交育種中貢獻(xiàn)較大有關(guān)，作為雜交育種親本，差異一般都較大。

研究還表明我省選育品種和地方材料的遺傳差異大于引進(jìn)品種。貴州省屬山區(qū)氣候特點(diǎn)，生態(tài)環(huán)境差異比較大，栽培選育的煙草品種之間的差異也較大，這有利于我省煙草品種資源的利用與發(fā)展。筆者認(rèn)為結(jié)合煙區(qū)生態(tài)條件，充分發(fā)揮貴州煙葉生產(chǎn)地區(qū)生態(tài)環(huán)境差異大的優(yōu)勢(shì)，加強(qiáng)對(duì)現(xiàn)有特色品種的改良，在突出地方特色品種風(fēng)格的基礎(chǔ)上，提高綜合性狀，可培育一批具有鮮明地方特色的新品種。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與實(shí)際材料的親緣關(guān)系基本一致，并揭示了不同品種的遺傳基礎(chǔ)，表明同科植物的SSR引物可對(duì)煙草種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳差異分析，而且也可為煙草品種的鑒定、遺傳分析和核心種質(zhì)的構(gòu)建提供可靠信息，有著潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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