重度子癇前期患者胎盤組織缺氧適應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)及意義

欒南南，喬寵，欒奡，何政，尚濤，王永來

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽 110004；2.鳳城市中醫(yī)院婦產(chǎn)科，遼寧 鳳城 118000）

子癇前期是妊娠期特有的并發(fā)癥之一，嚴(yán)重危及母嬰健康和生命安全，其致病機(jī)制仍不明確。目前研究發(fā)現(xiàn)子癇前期患者胎盤血流量較正常妊娠明顯減少［1］。胎盤著床部位的子宮淺肌層的子宮螺旋動(dòng)脈生理性擴(kuò)張較少，動(dòng)脈粥樣硬化等病理性改變，導(dǎo)致子宮-胎盤缺血缺氧，使胎盤釋放大量毒性因子，導(dǎo)致子癇前期的一系列癥狀［2］。近年的研究證明，缺氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia inducible transcription factors，HIF-1）參與機(jī)體對(duì)缺氧的反應(yīng)［3］，調(diào)節(jié)了胎盤血管形成［4］。HIF-1α是HIF-1的功能亞基。氧感受器缺氧誘導(dǎo)因子脯氨酸羥化酶（prolyl hydroxylase domain-containing protein，PHD）和因子抑制低氧誘導(dǎo)因子 1（Factor inhibiting HIF-1，F(xiàn)IH-1）可以從蛋白含量和功能兩個(gè)方面調(diào)節(jié)HIF-1α［5］。其中PHD有4 種同功酶，分別為 PHD1、PHD2、PHD3、PHD4。本文通過免疫組化方法檢測重度子癇前期患者和正常妊娠婦女胎盤組織中的 HIF-1α、PHD1、PHD2 和FIH-1蛋白的表達(dá)，并探討它們?cè)谥囟茸影B前期發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 對(duì)象

重度子癇前期組：選擇2006年7月至2007年7月在中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院產(chǎn)科住院接受剖宮產(chǎn)終止妊娠的重度子癇前期患者34例（30周≤孕周≤38周），平均年齡（29.41±4.82）歲（22~37歲），診斷參照樂杰主編《婦產(chǎn)科學(xué)》（第7版）［6］。正常晚期妊娠組：選擇同期在我科住院行擇期剖宮產(chǎn)的正常晚期妊娠孕婦（37周≤孕周≤41周）共24例為對(duì)照，平均年齡（29.83±4.73）歲（21~38歲），本次妊娠經(jīng)過正常，胎兒發(fā)育正常，無任何合并癥和并發(fā)癥，既往無不良妊娠史，無原發(fā)性高血壓、心臟病、糖尿病、腎病等病史。2組孕婦年齡比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。所有孕婦均在知情后簽署經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的同意書，

1.2 方法

1.2.1 組織標(biāo)本收集及處理：剖宮產(chǎn)術(shù)中于胎盤娩出后，無菌條件下用手術(shù)刀立即切取臍帶附著處全層胎盤組織（平均厚度約2 cm）兩塊，每塊1 mm×1 mm×1 mm約300 mg左右，用滅菌生理鹽水反復(fù)漂洗后，置入4%中性多聚甲醛中固定，用于免疫組化測定。

1.2.2 免疫組化法檢測胎盤組織中HIF-1α、PHD1、PHD2和FIH-1蛋白的表達(dá)：即用型SP免疫組化染色試劑盒購于武漢博士德公司，操作步驟按照說明書進(jìn)行。鼠抗人HIF-1α單克隆抗體購自武漢博士德公司，驢抗人PHD1、2單克隆抗體、兔抗人FIH-1單克隆抗體均購自BETHYL公司。一抗工作滴度均為1∶800。磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。1.2.3每例樣本選取5張染色效果良好的切片，每張免疫組化切片均觀察10個(gè)高倍視野，根據(jù)陽性細(xì)胞比例及著色深淺計(jì)分：細(xì)胞無著色或無陽性細(xì)胞為0分，細(xì)胞染色為淺棕色或陽性細(xì)胞1%~25%為1分，細(xì)胞染色為深棕色或陽性細(xì)胞26%~50%為2分，細(xì)胞染色為棕褐色或陽性細(xì)胞>50%為3分；根據(jù)計(jì)分結(jié)果判斷陽性等級(jí)：0~1分為（-），2分為（+），3~4分為（++），5~6分為（+++）。計(jì)算每塊組織的平均得分作為每個(gè)樣本的最終評(píng)分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2組間比較采用χ2檢驗(yàn)分析，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

在重度子癇前期和正常晚期妊娠的胎盤組織中，HIF-1α、PHD1、PHD2 和 FIH-1 蛋白均主要表達(dá)于合體滋養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞的胞質(zhì)中，絨毛間質(zhì)細(xì)胞中少見，見圖1~4。具體表達(dá)水平見表1。在重度子癇前期組的胎盤組織中，HIF-1α和PHD2的陽性表達(dá)率明顯高于對(duì)照組；而PHD1和FIH-1的表達(dá)卻明顯降低。2組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.01）。

圖1 重度子癇前期患者胎盤組織中HIF-1α蛋白的表達(dá)Fig.1 The expression of HIF-1αin placenta of preeclampsia

圖2 正常晚期妊娠孕婦胎盤組織中PHD1蛋白的表達(dá)Fig.2 The expression of PHD1 in placenta of normal pregnancy

圖3 重度子癇前期患者胎盤組織中PHD2蛋白的表達(dá)Fig.3 The expression of PHD2 in placenta of preeclampsia

圖4 正常晚期妊娠胎盤組織中FIH-1蛋白的表達(dá)Fig.4 The expression of PHD2in placenta of normal pregnancy

表1 正常妊娠及重度子癇前期胎盤組織中HIF-1α、PHD1、PHD2和FIH-1表達(dá)結(jié)果比較Tab.1 Expressions of HIF-1α，PHD1，PHD2 and FIH-1 in palcenta of normal pregnancy and preeclampsia

3 討論

HIF-1是由α和β亞基組成的異二聚體。α亞基的401~603位氨基酸為氧敏感區(qū)，稱為氧依賴降解區(qū)（oxygen dependent degradation domain，ODD），是影響降解的主要結(jié)構(gòu)。在缺氧條件下HIF-1α在細(xì)胞內(nèi)迅速聚集，并與β亞基結(jié)合后誘導(dǎo)其下游近百種基因的轉(zhuǎn)錄，引起細(xì)胞對(duì)缺氧的一系列適應(yīng)性反應(yīng)［7］。在維持腫瘤細(xì)胞的能量代謝、血管擴(kuò)張、新生血管形成、細(xì)胞增殖、胎盤形成等各方面都起到重要作用［8］。

HIF-1α內(nèi)ODD上的脯氨酸殘基的羥基化是其降解的關(guān)鍵，脯氨酸羥化酶（PHD）是這一步驟的限速酶。而FIH-1則通過羥化HIF-1αC端包含的反式激活結(jié)構(gòu)域（trans-activation domain，TAD）的天冬酰胺殘基降低其轉(zhuǎn)錄激活活性。PHD4種同工酶中的PHD1在長時(shí)間缺氧狀態(tài)下對(duì)HIF-1α的降解有重要意義，而PHD2是正常氧分壓狀態(tài)下低穩(wěn)態(tài)水平HIF-1α 的限速酶［9］，且是直接受 HIF-1α 調(diào)控的靶基因，增高的HIF-1α可誘導(dǎo)其表達(dá)［10］。因此我們推測PHD和FIH-1有可能通過調(diào)節(jié)HIF-1α來參與子癇前期的發(fā)病。

我們研究表明在重度子癇患者胎盤組織中HIF-1α的蛋白表達(dá)顯著增高。同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)PHD1和FIH-1蛋白的表達(dá)都明顯降低，而PHD2的表達(dá)與HIF-1α一致，在子癇前期患者的胎盤組織中顯著升高。

由此我們推測在重度子癇前期患者胎盤組織中，氧感受器PHD1和FIH-1減少，使對(duì)HIF-1α的抑制作用減弱，導(dǎo)致HIF-1α降解減少，轉(zhuǎn)錄活性增加，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝模式，以無氧代謝適應(yīng)缺氧環(huán)境；并誘導(dǎo)新生血管生成以增加局部供氧。而同時(shí)機(jī)體啟動(dòng)反饋機(jī)制，誘導(dǎo)PHD2的表達(dá)增多，促進(jìn)HIF-1α的水解，以防止過多HIF-1α聚集導(dǎo)致其下游的一系列基因的大量產(chǎn)生，對(duì)機(jī)體造成損害。然而，當(dāng)這種保護(hù)作用不足以抵消PHD1和FIH-1表達(dá)減少所導(dǎo)致的HIF-1α聚集以及轉(zhuǎn)錄活性增加時(shí)，使HIF-1α過表達(dá)并活性過強(qiáng)時(shí)，使其下游各種因子大量表達(dá)，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒害作用，就導(dǎo)致了子癇前期的發(fā)病和進(jìn)展。

綜上所述，根據(jù) HIF-1α、PHD1，PHD2 和 FIH-1四者之間相互的關(guān)系，我們考慮可以設(shè)計(jì)藥物或者通過基因治療增加PHD1，PHD2和FIH-1的表達(dá)或活性，抑制HIF-1α的表達(dá)和活性，促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的浸潤，并抑制下游缺氧相關(guān)基因的表達(dá)，達(dá)到預(yù)防重度子癇前期的發(fā)病、控制病情進(jìn)展、改善新生兒預(yù)后的目的，為開辟重度子癇前期的治療新途徑提供理論依據(jù)。

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