Lewisy抗原及α1，2-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因在卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)

梁秀云，林蓓，劉娟娟，高利利，王燕燕，劉大我，嚴(yán)麗梅，張淑蘭

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽 110004）

卵巢癌發(fā)病率居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第三位，近年有上升趨勢(shì)。由于卵巢腫瘤發(fā)病和進(jìn)展隱匿，確診時(shí)70%已屬晚期，晚期卵巢癌5年生存率僅約30%［1］。卵巢癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移、耐藥是造成卵巢癌治療困難的主要原因。巖藻糖基可參與構(gòu)成某些重要黏附分子的糖鏈結(jié)構(gòu)，在腫瘤的增殖、黏附及轉(zhuǎn)移機(jī)制上起重要作用［2~4］。Lewisy抗原是含有雙巖藻糖的寡糖，一些腫瘤標(biāo)志物的分子結(jié)構(gòu)中如卵巢癌相關(guān)標(biāo)志物CA125和MUC-1也含有Lewis y結(jié)構(gòu)，說明Lewisy抗原與上皮性卵巢癌有關(guān)［5］。我們的前期工作中利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)建立了α1，2-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶（α1，2-fucosyltransferases，α1，2-FT） 基因及Lewis y抗原高表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞RMG-I-H，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為明顯增強(qiáng)［6］。由于Lewisy抗原位于細(xì)胞表面，在生物檢測(cè)和生物治療方面有著廣闊的應(yīng)用遠(yuǎn)景。

本研究通過檢測(cè)α1，2-FT基因FUT1轉(zhuǎn)染前后的人卵巢癌細(xì)胞系RMG-I和RMG-I-H、人卵巢癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系HO8910PM及親本細(xì)胞系HO8910、人卵巢癌耐藥細(xì)胞系COC1/DDP及親本細(xì)胞系COC1中Lewis y抗原及FUT1基因的表達(dá)，進(jìn)一步證明Lewis y抗原與腫瘤的耐藥和轉(zhuǎn)移關(guān)系，為我們進(jìn)一步研究Lewis y抗原對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響及作用機(jī)制，為研究卵巢癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為卵巢癌的早期診斷及靶器官治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系：人卵巢癌細(xì)胞系RMG-I細(xì)胞來自人卵巢透明細(xì)胞癌組織，由日本近畿大學(xué)巖森正男教授惠贈(zèng)；RMG-I-H 細(xì)胞為 α1，2-FT（FUT1）及 Lewis y抗原穩(wěn)定高表達(dá)卵巢癌細(xì)胞系，在我們前期研究中已建立［8］；人卵巢癌細(xì)胞株HO8910PM、HO8910、COC1/DDP和COC1購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。

1.1.2 主要材料與儀器：DMEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基、胎牛血清（美國GIBCO公司產(chǎn)品）；鼠抗人Lewis y單克隆抗體（英國Abcam公司）；TRITC標(biāo)記的兔抗小鼠IgG抗體（DAKO公司產(chǎn)品）；SP試劑盒（福州邁新公司）；RT-PCR試劑盒（大連寶生物工程公司）；Trizol試劑，PrimeScriptTMRTreagent kit、SYBR誖Premix Ex TaqTM購于大連TaKaRa生物工程公司；引物序列由上海Invitrogen公司合成；其余化學(xué)藥品均為國產(chǎn)分析純；臺(tái)式低溫超速離心機(jī)3-16K（美國Sigma-Aldrich公司）；電泳儀（美國Bio-Rad公司）；電泳槽（美國Bio-Rad公司）；自動(dòng)凝膠成像分析儀GDS8000（美國 UVP 公司）；PCR 擴(kuò)增儀（480，2400，9600型）（美國PerkinElmer公司）；紫外分光光度儀（UV300，PYE-WNICAM/SPECTRONIC）（上海生物儀器廠）；倒置顯微鏡及照相系統(tǒng)IX70（日本OLYMPUS公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：RMG-I和RMG-I-H細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中飽和濕度培養(yǎng)；HO8910PM和HO8910人卵巢癌細(xì)胞株接種于含10%小牛血清的RpMI1640培養(yǎng)液中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；COC1（懸浮生長(zhǎng)）培養(yǎng)于37℃，5%CO2，含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中。COC1/DDP（懸浮生長(zhǎng)）順鉑耐藥細(xì)胞株，應(yīng)用藥物連續(xù)作用并逐步提高藥量的遞增壓力選擇法，在同樣的條件下使其能在0.5 pg/mL順鉑的1640培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長(zhǎng)。

1.2.2 細(xì)胞總RNA提?。喝∫陨?種細(xì)胞（各約1×107個(gè)細(xì)胞）加1 mLTRIZOL試劑，室溫放置5~10 min以裂解細(xì)胞，收集裂解液于Eppendorf管，一步法提取細(xì)胞總RNA。紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度。按照大連TaKaRa生物工程公司RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)量cDNA濃度和純度。證明合成的cDNA適用于下一步的實(shí)時(shí)PCR分析。

1.2.3 Quantitative RT-PCR檢測(cè)：利用Quantitative RT-PCR測(cè)定以上6種細(xì)胞中FUT1基因及內(nèi)源對(duì)照3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）基因表達(dá)水平。FUT1 PCR引物序列為 F：5′AGGTCATCCCTGAGCTGAAACGG 3′；R：5′CGCCTGCTTCACCACCTTCTTG3′。GAPDH引物序列為 F：5′GGACTTCGAGCAAGAGATGG3′；R：5′ACATCTGCTGGAAGGTGGAC3′。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系包括：SYBR誖Premix Ex TaqTM（2×）5 μl，PCR Forward Primer（5 μmol/L）0.5 μL，PCR Reverse Primer（5μmol/L）0.5μL，cDNA 1μL，dH2O 3 μL。反應(yīng)條件為：95 °C 變性 20 s，60°C 退火 60 s，共45個(gè)循環(huán)。應(yīng)用Light Cycler PCR檢測(cè)系統(tǒng)（Roche Diagnostics，Mannheim，德國）進(jìn)行 Real-time PCR 擴(kuò)增并檢測(cè)各范本的Ct值。擴(kuò)增完畢后，進(jìn)行溶解曲線分析。目的基因表達(dá)倍數(shù)的改變利用2－ΔΔCT法進(jìn)行計(jì)算。2－ΔΔCT結(jié)果＞1.4 或者＜0.6 被認(rèn)為是有意義。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè)：各取4μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件為50℃30 min，95℃5 min，5℃5 min。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.5μL行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：10×緩沖液2.5μL，2.5 mmol/L脫氧核苷三磷酸2 μL，5 U/μL 的 Taq聚合酶 0.2μL，上下游引物各 0.5 μL，cDNA 2.5μL，H2O 16.8μL，總體積 25μL；反應(yīng)條件為：94℃，5 min后，94℃，40 s；退火溫度，62℃，1 min；72℃，1 min，最后為 72℃，7 min，35循環(huán)。PCR產(chǎn)物在3.5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳后，經(jīng)電泳凝膠成像分析儀ALPHA IMAGER 5500拍照并分析處理。β-actin 引物序列為 F：5′GGACTT-CGAGCAAGAGATGG3′；R：5′ACATCTGCTGGAAGGTGGAC3′擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度，404 bp。

1.2.5 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)：取RMG-I-H和RMG-I、HO8910PM和HO8910細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定。免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法按SP試劑盒說明書進(jìn)行。Lewis y單抗 AH6，1∶100稀釋；IgM 二抗，1∶100稀釋。以細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜有棕黃色顆粒著色為陽性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。圖像分析軟件Meta Morph分析結(jié)果。

將懸浮細(xì)胞COC1/DDP和COC1分別放入離心管中，1 000 r/min離心5 min，用PBS洗2次，用少量的PBS把細(xì)胞涂于預(yù)先用多聚賴氨酸處理好的載玻片上，玻片待干燥時(shí)用4%多聚甲醛固定。其余步驟同上。

1.2.6 免疫細(xì)胞熒光檢測(cè)：細(xì)胞爬片和涂片同免疫細(xì)胞化學(xué)。4%多聚甲醛固定20 min，用PBS洗2次，每次3 min，5%BSA封閉30 min，加入一抗（抗Lewisy 1∶100）。4℃過夜。二抗TRITC標(biāo)記的兔抗小鼠IgG單抗，1∶50稀釋，避光37℃1 h，暗室內(nèi)40倍鏡下拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，檢測(cè)數(shù)據(jù)以x±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3對(duì)細(xì)胞系中Lewisy抗原的表達(dá)

SP染色結(jié)果表明，Lewis y分布于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，Lewis y在 RMG-I、HO8910、COC1 細(xì)胞中染色陽性顆粒呈淡黃色，分布彌散，累積光密度分別為（32.18±0.64），（14.96±0.61）和（19.26±0.83）（圖 1），在 RMG-I-H、HO8910PM和COC1/DDP細(xì)胞中，染色陽性顆粒呈棕黃色或棕褐色，分布廣泛，其累積光密度分別為（53.90±4.33），（37.31±0.19）和（28.52±1.45）。均比相應(yīng)的RMG-I、HO8910、COC1細(xì)胞明顯增強(qiáng)（P均<0.05）。在相同的瀑布強(qiáng)度下免疫細(xì)胞熒光檢測(cè)結(jié)果顯示RMG-I-H、HO8910PM和COC1/DDP細(xì)胞中熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于RMG-I、HO8910、COC1細(xì)胞（圖2）。

圖 1 RMG-I和 RMG-I-H、HO98910和 HO8910PM、COC1和COC1-DDP細(xì)胞系中Lewis y的表達(dá)×400Fig.1 Lewis y expression in RMG-Iand RMG-I-H，HO98910 and HO8910PM，COC1 and COC1-DDP celllines×400

圖 2 RMG-I和RMG-I-H、HO98910和HO8910PM、COC1和COC1-DDP細(xì)胞系中Lewis y的表達(dá)×400Fig.2 Immunofluorescence microscopy of Lewis y carbohydrate determinants from RMG-I-H and RMG-I，HO98910 and HO8910PM，COC1 and COC1-DDP ovarian carcinoma cells×400

2.2 3對(duì)細(xì)胞系中FUT1基因的表達(dá)

Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果證明，RMG-I-H細(xì)胞中FUT1的mRNA相對(duì)表達(dá)量較RMG-I細(xì)胞升高了3.07倍（P<0.05），HO8910PM細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量較HO8910細(xì)胞升高了2.13倍（P<0.05），COC1/DDP細(xì)胞中相對(duì)表達(dá)量比COC1細(xì)胞升高了2.42倍（P<0.05）（表1）。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示RMG-I-H、HO8910PM和 COC1/DDP細(xì)胞中 FUT1基因的相對(duì)表達(dá)明顯強(qiáng)于RMG-I、HO8910、COC1細(xì)胞中FUT1基因的表達(dá)（圖3）。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定6種細(xì)胞中FUT1基因的表達(dá)水平Tab.1 Real-time PCR determine the gene expression of FUT1 in these six cells

圖 3 RMG-I和 RMG-I-H、HO8910和 HO8910PM、COC1和COC1/DDP中FUT1 mRNA的相對(duì)表達(dá)Fig.3 The mRNA expression of FUT1 in RMG-I and RMG-I-H，HO8910 and HO8910PM，COC1 and COC1/DDP cell lines

3 討論

近年來，越來越多的研究表明糖復(fù)合物上的糖鏈結(jié)構(gòu)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、分子黏附等，與細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、運(yùn)動(dòng)、分化等重要生命過程密切相關(guān)［8~10］。細(xì)胞癌變后細(xì)胞膜上的糖復(fù)合物、特別是糖鏈部分發(fā)生結(jié)構(gòu)和量的變化。卵巢癌主要表現(xiàn)為Ⅱ型糖鏈的改變，如Lewisy抗原。研究表明75%的上皮性卵巢癌出現(xiàn)Lewis y不同程度的過量表達(dá)，且增高的患者預(yù)后不良［11，12］。

Lewis y抗原是某些糖蛋白和糖脂的末端寡糖，為雙巖藻糖寡糖，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為［Fuc1→2Gal1→4（Fuc 1→3）GlcNAc］，即糖鏈非還原末端的二糖-半乳糖-N-乙酰氨基葡萄糖（Gal-N-GlcNAc），在其外側(cè)的半乳糖上連接有α1→2巖藻糖（Fuc）及α1→3巖藻糖（Fuc）而形成。研究證實(shí)，α1，2-FucT 中FUT1是Lewisy寡糖的特異性合成酶 FUT1［14］。

前期我們利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將FUT1導(dǎo)入人卵巢癌細(xì)胞系RMG-I，首次建立了α1，2-FT基因及l(fā)ewisy穩(wěn)定高表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞模型RMG-I-H。并且證明在卵巢癌細(xì)胞RMG-I-H中，α1，2-FT基因及Lewisy抗原使其增殖、侵襲等惡性細(xì)胞生物學(xué)能力增加的同時(shí)，對(duì)卵巢癌化療中的常用藥物卡鉑、5-氟尿嘧啶及紫杉醇的耐藥性也提高［2，4，6］。基因轉(zhuǎn)染后細(xì)胞系RMG-I-H與RMG-I相比，RMG-I-H中的多藥耐藥相關(guān)蛋白1、多藥耐藥相關(guān)蛋白2、蛋白激酶C-α及拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ的基因表達(dá)均明顯上調(diào)，在RMG-I-H及其裸鼠移植瘤中P-gp在基因和蛋白水平表達(dá)都明顯增高［14］。Lewis y抗體能明顯抑制體內(nèi)外細(xì)胞的生物學(xué)特性的改變［15］。Chhieng等［16］用免疫組化法分別檢測(cè)了在原發(fā)性卵巢癌及轉(zhuǎn)移灶組的Lewisy表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Lewisy抗原的表達(dá)在原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶無明顯差異。這些結(jié)果證實(shí)，Lewisy抗原在卵巢癌的惡性生物學(xué)行為中扮演重要角色，與卵巢癌細(xì)胞耐藥和轉(zhuǎn)移能力有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在RMG-I-H中，Lewisy抗原和FUT1基因高表達(dá)使其在增殖和耐藥及侵襲能力上都比RMG-I增強(qiáng)；而人高轉(zhuǎn)移卵巢癌細(xì)胞HO8910PM中，Lewis y抗原及FUT1基因的表達(dá)都較其親本細(xì)胞HO8910中的表達(dá)量升高，Lewis y抗原升高1.6倍，F(xiàn)UT1基因升高2.13倍（P均<0.05）；在人耐藥卵巢癌細(xì)胞COC1/DDP中，Lewisy抗原及FUT1基因的表達(dá)量也較其親本細(xì)胞COC1中的表達(dá)量升高，Lewis y抗原升高1.6倍，F(xiàn)UT1基因升高了2.42倍。FUT1基因及l(fā)ewis y抗原高表達(dá)可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖和耐藥及侵襲能力增強(qiáng)，而在高轉(zhuǎn)移能力及耐藥的腫瘤細(xì)胞中同樣檢測(cè)到有FUT1基因及Lewis y高表達(dá)。不難推斷FUT1基因及Lewisy抗原在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)比較普遍，可能作為共性參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后。

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