內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其特有凋亡途徑Caspase-12與糖尿病大鼠腎組織固有細胞凋亡之間的關(guān)系*

曹延萍，郝詠梅，劉青娟，王 建，李 航，段惠軍△

(1.河北醫(yī)科大學(xué)病理教研室，2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院內(nèi)分泌科，石家莊 050017;3.邯鄲市第一醫(yī)院急診科，河北 邯鄲 056002)

糖尿病腎組織損害是糖尿病(DM)最嚴重的微血管并發(fā)癥之一，腎臟固有細胞過度凋亡導(dǎo)致的細胞增殖與凋亡關(guān)系的不平衡是腎臟功能惡化甚至衰竭的重要機制，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是近年來新發(fā)現(xiàn)的介導(dǎo)細胞凋亡的途徑之一，并已證明在糖尿病臟器損害過程中普遍存在。本研究觀察了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)標志蛋白GRP78及其特有的凋亡途徑Caspase-12的表達及其與腎臟固有細胞凋亡之間的關(guān)系，探討ERS是否存在于糖尿病腎損害過程中以及相應(yīng)的作用，為臨床尋求防治糖尿病腎損害的有效方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

Wistar雄性大鼠由河北省實驗動物中心提供。鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ，Sigma公司)。小鼠抗大鼠PCNA單克隆抗體(武漢博士德生物工程公司)，兔抗GRP78單克隆抗體(NeoMarkers公司)，CASPASE-12單克隆抗體(abcam生物制品有限公司)，TUNEL試劑盒(Promega公司)

1.2 方法

1.2.1 動物模型及分組 選取體重 120～140g Wistar大鼠24只，隨機分A組:右腎切除對照組(n=10);B組:糖尿病(DM)組(n=14)。所有大鼠均用戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉，行右腎切除術(shù)，2周后大鼠切口完全愈合。B組大鼠按65 mg/kg腹腔注射STZ(溶于0.1 mol/L枸椽酸緩沖液中，pH值4.5)，A組只注射相當體積的枸椽酸緩沖液，48 h后于大鼠尾尖取血。血糖儀測定血糖，并測尿糖。血糖≥16.7 mmol/L，尿糖+++～++++者確定為DM模型。實驗期間動物自由進飲食，不使用胰島素及其他降糖藥物。

1.2.2 標本收集 DM模型建成后，每周測血糖1次，不符合標準者棄去;于成模8周稱重后用代謝籠收集24h尿，乙醚麻醉，股動脈取血，分離血清，用于生化指標測定。切取左腎，去掉被膜，濾紙吸干血跡后稱重，部分置于4%多聚甲醛固定留做HE、PAS染色及免疫組化、TUNEL檢測，部分置于70%乙醇固定后行流式細胞術(shù)檢測。

1.2.3 血、尿生化指標測定 血糖(blood glucose，Glu)、血肌酐(Serum creatinine，Scr)、尿肌酐(Urine creatinine，Ucr)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、尿蛋白均用日立7170A全自動生化分析儀測定，并計算肌酐清除率(creatinine clearance，Ccr)。

1.2.4 常規(guī)病理學(xué)觀察 腎組織石蠟包埋后切片2μm，常規(guī) HE、高碘酸-希夫(PAS)染色 ，光鏡下觀察腎組織形態(tài)學(xué)改變。

1.2.5 免疫組織化學(xué)檢測 采用SP法。2μm腎組織切片，常規(guī)脫蠟至水，一抗 PCNA、GRP78(1∶100)，Caspase-12(1∶1000)稀釋 ，二抗為生物素化山羊抗兔IgG，PBS替代一抗作為陰性對照，DAB顯微鏡控制下顯色。免疫組化結(jié)果應(yīng)用IPP圖文分析軟件分析，每張切片取10個高倍視野，綜合陽性面積和染色深度計算陽性區(qū)域的積分光密度值(IOD)，以各組的均值進行比較。

1.2.6 TUNEL法檢測細胞凋亡 腎臟2μm切片常規(guī)脫蠟入水，蛋白酶K室溫下消化，TDT酶反應(yīng)液37℃孵育1 h，0.3%H2O2抑制內(nèi)源性過氧化物酶，Streptavidin-HRP室溫5 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。陰性對照采用無酶標記液(刪除TDT)代替TDT酶反應(yīng)液。凋亡細胞核呈棕褐色顆粒，光鏡下觀察并計數(shù)凋亡細胞。

1.2.7 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡水平及GRP78和Caspase-12的表達 將標本用網(wǎng)搓法制成單細胞懸液，采用間接免疫熒光法，在細胞懸液中分別加入1∶200稀釋的兔抗GRP78和1∶1000的兔抗Caspase-12單克隆抗體，37℃溫浴30min后洗滌，加入羊抗兔FITC-IgG，溫浴洗滌后行流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司，Epics-XLⅡ型)檢測，測量的數(shù)據(jù)應(yīng)用相應(yīng)的程序進行資料處理，測定前以標準樣品調(diào)整儀器CV值在2%以內(nèi)。GRP78和Caspase-12表達的定量分析以熒光指數(shù)(FI)表示其相對含量:FI=(樣品的平均熒光強度-對照樣品平均熒光強度)/正常組織平均熒光強度;

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般情況

實驗期間，B組Glu明顯升高，并逐漸出現(xiàn)多飲多食、多尿、毛色晦暗和體重下降等癥狀，建模8周，B組與A組相比，BUN，Scr及尿蛋白等指標均顯著升高。一只出現(xiàn)白內(nèi)障。整個實驗過程中B組1只大鼠死亡，1只血糖未達成膜標準，予以剔除。最終共22只完成實驗，其中A組10只，B組12只。

2.2 腎功能改變

8周時B組與A組相比，血糖、BUN和尿蛋白明顯增高，Ccr顯著降低(P＜0.05，表 1)

Tab.1 Serum glucose，blood urea nitrogen，creatinine clearance and 24h urinary protein excretion in control group and diabetic group()

Tab.1 Serum glucose，blood urea nitrogen，creatinine clearance and 24h urinary protein excretion in control group and diabetic group()

Glu:Serum glucose;Pro:24h urinary protein excretion;BUN:Blood urea nitrogen;Ccr:creatinine clearance*P＜0.05 vs control group

Group n Glu(mmol/L)Pro(mg/24h)BUN(mmol/L)Ccr(ml/min)Control 10 8.68±0.66 6.57±1.03 5.81±0.13 0.64±0.21 Diabetic 12 20.15±1.56* 17.42±1.22* 12.98±2.04* 0.20±0.16*

2.3 腎組織病理學(xué)檢查

光鏡下對照組腎組織未見病理改變，糖尿病組大鼠腎小球細胞外基質(zhì)略增生，腎小管上皮細胞腫脹，可見空泡變性，部分萎縮或擴張，小動脈管壁略增厚(圖1)。

Fig.1 HE staining in renal cortex at week 8(×100)

2.4 免疫組織化學(xué)檢測

PCNA、GRP78及Caspase-12在腎臟定位表達:PCNA、GRP78、Caspase-12在正常對照組大鼠腎皮質(zhì)均有表達，PCNA陽性細胞為細胞核呈棕黃色，在100倍視野中連續(xù)不重疊的計數(shù)100個腎小管的細胞總數(shù)和陽性細胞數(shù)及50個腎小球的陽性細胞數(shù)，以腎小管細胞的陽性率和單個腎小球切面的陽性細胞數(shù)作為比較指標。對照組和糖尿病組腎皮質(zhì)小球、小管內(nèi)均可見陽性細胞，差別無統(tǒng)計學(xué)意義。GRP78在正常對照組弱表達，主要位于遠端小管和集合管上皮細胞胞漿內(nèi);糖尿病組卻是廣泛的強陽性表達，尤以近曲小管胞漿最為顯著，部分腎小球內(nèi)細胞胞漿也呈強陽性表達，兩組的陽性著色區(qū)域積分光密度值分別為4177.50±1864.22和147085±8626.40，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖2)。Caspase-12正常對照組有表達，主要位于腎小管上皮細胞胞漿內(nèi)，糖尿病組表達明顯增強，小管及小球內(nèi)均可見陽性表達，陽性區(qū)域的積分光密度值分別為74207.33±6980.38和175874.0±7826.11，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖3)。

Fig.2 Immunohistochemical staining of GRP78 protein in renal cortex at week 8(×100)

Fig.3 Immunohistochemical staining of Caspase-12 protein in renal cortex at week 8(×100)

2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡程度及對GRP78和Caspase-12半定量分析結(jié)果

糖尿病組細胞凋亡率(圖4)、GRP78及Caspase-12表達程度較正常對照組明顯增高(P＜0.01，表2)

Fig.4 Apoptosis rate of cells in renal cortex at week 8 by FCM

Tab.2 Examin the expression of GRP78 、Caspase-12 protein and apoptosis rate by flow cytometry(，F(xiàn)I)

Tab.2 Examin the expression of GRP78 、Caspase-12 protein and apoptosis rate by flow cytometry(，F(xiàn)I)

FI:Fluorescence intensity;GRP78:78kDa glucose-regulated protein*P＜0.01 vs control group

Group n GRP78(ng/ml) Caspase-12(ng/ml) Apoptosis rate(%)Control 10 1.000±0.047 1.000±0.057 7.872±1.143 Diabetic 12 1.182±0.026* 2.000±0.300* 12.264±0.523*

2.6 TUNEL定位檢測腎臟凋亡細胞

正常對照組腎小管偶見凋亡細胞，糖尿病組細胞凋亡數(shù)明顯增高，小球、小管內(nèi)均有陽性表達，但主要位于小管上皮細胞，尤以皮髓質(zhì)交界處多見(圖5見下頁)。

3 討論

Fig.5 Assessment of the apoptotic cells in renal cortex at week 8 by TUNEL staining(×100)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病(DM)最嚴重的微血管并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致終末腎衰竭的常見原因，腎臟固有細胞過度凋亡引起的細胞增殖與凋亡關(guān)系的不平衡是腎臟功能惡化甚至衰竭的重要機制。本實驗以流式細胞術(shù)及TUNEL染色檢測糖尿病大鼠腎組織細胞凋亡程度及定位，以免疫組織化學(xué)檢測糖尿病大鼠腎組織中PCNA的表達，以此代表細胞的增殖水平，結(jié)果顯示，DM大鼠8周時腎組織中細胞凋亡數(shù)較正常對照組明顯增高，TUNEL染色與流式細胞術(shù)結(jié)果相吻合，DM組腎組織凋亡細胞主要位于小管上皮細胞，部分腎小球也有陽性表達，然而二組間腎小球和腎小管細胞PCNA的陽性細胞數(shù)與對照組比較差別無統(tǒng)計學(xué)意義，提示與細胞增殖程度相比，建模8周DM組腎臟細胞過度凋亡，成熟的腎小管上皮細胞增殖能力較弱，足細胞是終末分化的細胞，幾乎沒有增殖能力，腎臟固有細胞過多凋亡可能是促進糖尿病腎臟損害和腎功能惡化的重要原因之一。

凋亡的起源問題，既往認為線粒體在其發(fā)生過程中起核心作用，近來研究結(jié)果證明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在控制細胞命運中具有更重要的作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)是真核細胞中蛋白質(zhì)翻譯合成和細胞內(nèi)鈣離子的儲存場所，對細胞應(yīng)激反應(yīng)起調(diào)節(jié)作用。缺血、缺氧、錯誤折疊蛋白的積聚、Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡等都可干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常生理功能，這種亞細胞器病理狀態(tài)稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。ERS激活未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)，使蛋白質(zhì)生物合成減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的降解功能增強，從而降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負擔，維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，如果ERS持續(xù)存在，則可能誘發(fā)凋亡。研究表明，高糖可以誘導(dǎo)引起ERS的許多因素[1]，據(jù)報道，高糖影響內(nèi)環(huán)境中的Ca2+，抑制Ca2+通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的能力，使得Ca2+在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲積、釋放以及再次泵人障礙，并且，高糖易引起氧化產(chǎn)生過氧化氫并產(chǎn)生活性中間體，氧化應(yīng)激在DM腎損傷中起重要作用[2、3]，氧化應(yīng)激與ERS呈正相關(guān)[4]。除了高血糖，低氧、脂質(zhì)沉積、分泌性蛋白合成增多等因素均可引起ERS，并有研究證實，DM腎損害過程中激發(fā)了ERS并在其發(fā)病機制中扮演重要角色[5]。

78 kDa-糖調(diào)節(jié)蛋白(78-kDa glucose-regulated protein，GRP78)屬于熱休克蛋白(HSP70)家族，也稱免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(immunoglobulin heavy chain binding protein(BiP))，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白，通過與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激元件PKR、IRE1以及ATF6的結(jié)合抑制ERS的激活，在未折疊蛋白反應(yīng)中發(fā)揮主要調(diào)控作用[6]，生理情況下，GRP78在基礎(chǔ)水平表達，主要功能是作為分子伴侶參與新生多肽鏈的折疊、裝配和轉(zhuǎn)運，GRP78的誘導(dǎo)廣泛被認為是ERS的標志性分子[7][8]，本研究結(jié)果顯示，糖尿病組GRP78表達明顯高于對照組，主要位于腎皮質(zhì)近曲小管，部分腎小球也有表達，提示糖尿病大鼠腎臟損害過程中發(fā)生了ERS，且主要位于此區(qū)域。

早期ERS通過激活UPR及時有效的逆轉(zhuǎn)ERS增強細胞的存活能力，但ERS持續(xù)存在時，凋亡是其最終的結(jié)局。ERS可以激活多條途徑誘導(dǎo)細胞凋亡，盡管ERS介導(dǎo)的凋亡途徑并沒有完全闡明，但是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Caspase-12的活化已經(jīng)被確認參與這個過程[9]。Caspase-12定位于ER外膜，是介導(dǎo)ERS凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，在膜受體或線粒體凋亡途徑中不被活化[8][9]。Rao等[6]報道 ERS導(dǎo)致GRP78-procaspase12-procaspase7復(fù)合物形成，過度應(yīng)激最終使這一多聚復(fù)合物裂解，釋放活性Caspase-12，我們的結(jié)果顯示，正常對照組大鼠腎組織中Caspase-12僅有少量表達，DM組大鼠腎臟固有細胞凋亡數(shù)增多并伴有GRP78、Caspase-12表達上調(diào)，提示可能通過Caspase-12途徑介導(dǎo)腎臟固有細胞凋亡，參與糖尿病腎損害的發(fā)生發(fā)展過程并一定程度上介導(dǎo)了腎功能衰竭。研究表明，GRP78在大量白蛋白刺激鼠近端腎小管上皮細胞中呈高表達趨勢并誘導(dǎo)凋亡[10]，蛋白尿可以通過ERS相關(guān)凋亡途徑，激活Caspase-12引起腎小管損傷，此外，大量蛋白積聚可在體外培養(yǎng)的足細胞中誘導(dǎo)ERS引起足細胞損傷，而足細胞損傷對蛋白尿的進展發(fā)揮中心作用，本實驗糖尿病組大鼠8周時，已有大量蛋白尿形成，這是ERS的原因還是ERS的結(jié)果尚需進一步研究，進一步檢測ERS誘導(dǎo)的凋亡途徑在其發(fā)病中的地位以及通過干擾ERS不同環(huán)節(jié)，減少細胞凋亡，從而起到保護腎臟的作用，將為疾病治療方案的全新設(shè)計提供新思路。

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