骨鈣素在BMP2/7異源二聚體誘導種植體周圍骨缺損再生中的表達*

孫 平 王利民 馮劍穎

種植義齒可以提高口腔修復治療水平，提高缺牙患者的生活質(zhì)量。但眾多種植體周圍嚴重骨缺損患者也會給臨床治療帶來一定的難度。近年來，采用有效的新手段、新方法以促進骨再生是整形外科學、牙種植學、牙周病學的研究熱點。大量體內(nèi)外研究表明，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morpho genetic proteins，BMPs)是促進骨再生以及種植體周骨整合的有效手段[1]。但是，目前在利用BMP的治療手段中存在一個明顯的“瓶頸”，即BMP應用于臨床時的使用劑量很高(達mg級)[2]，這使得BMP蛋白質(zhì)臨床應用的費用增高，嚴重限制其臨床應用，而且高劑量應用BMP蛋白質(zhì)還存在一些不良反應，如刺激破骨細胞分化及功能，誘導骨形成后的快速骨吸收，非目的部位誘導骨生成，對神經(jīng)產(chǎn)生副作用等。而有學者研究純化BMP2/7異源二聚體蛋白可以有效克服此瓶頸，達到低劑量時即可有效刺激成骨，并且減少不良反應發(fā)生。有報道稱BMP2/7異源二聚體蛋白可以達到BMP同聚體蛋白15-20倍的成骨效率[3]。然而BMP2/7異源二聚體蛋白成骨的具體過程及機制仍不明了。

本課題組前期體內(nèi)研究[4]以10-150ng/ml濃度 的 rhBMP2/7、rhBMP2、rhBMP7刺 激MC3T3-E1細胞，檢測成骨發(fā)生各階段的相關指標，發(fā)現(xiàn)rhBMP2/7誘導MC3T3-E1趨化遷移、細胞增殖和細胞成骨分化的起效濃度和最佳濃度是rhBMP同源二聚體的1/10-1/2；研究發(fā)現(xiàn)在細胞成骨發(fā)生的早期階段，在較低濃度范圍內(nèi)(5-100ng/ml)，rhBMP2/7異源二聚體較rhBMP同源二聚體有較強作用優(yōu)勢。

本研究希望進行rhBMP2/7異源二聚體的體外實驗研究，擬建立小型豬種植體周骨缺損模型，并使用BMP2/7異源二聚體及BMP2、BMP7同源二聚體促進骨再生，使用免疫組化方法分別在2、3、6周時檢測新骨中骨鈣素表達，對成骨過程中骨鈣素的表達規(guī)律做初步探討。

1.材料與方法

1.1 動物分組及種植體骨缺損動物模型建立選用小型豬18只，9個月大，雌雄各半，體重約16.50kg-19.80kg。參照文獻報道[5]設立3個實驗觀察點，分別為2,3,6周，每個時間點處死6只動物。每只小型豬顱骨建立4個直徑為8mm圓柱狀骨缺損并植入直徑3.1mm種植體，缺損間隙處分別置入浸泡有BMP2/7異源二聚體、BMP2同源二聚體、BMP7同源二聚體的膠原海綿及單純的膠原海綿。以小型豬顱骨種植體周骨缺損為研究對象，分為4組：1)BMP2/7異源二聚體組;2)BMP2同源二聚體組;3)BMP7同源二聚體組;4)空白對照組

將 BMP2/7、BMP2、BMP7凍干粉(R&D System Inc,Minneapolis,USA)分別溶于 4mM HCL(含0.1%胎牛血清)中配制成濃度為0.05μg/μl溶液并滅菌保存。膠原海綿(Helistat,Integra公司,美國)裁成統(tǒng)一大小(15mm×4mm×2.5mm)并滅菌。每片海綿上吸附有100ulBMP混懸液，這樣每片海綿上有5ugBMP。純鈦種植體(直徑3.1mm，長度10mm，表面噴砂并酸蝕處理，由浙江廣慈醫(yī)療器械廠生產(chǎn))清潔好并滅菌處理。

小型豬使用速眠新0.3ml/kg靜脈全身麻醉后，手術區(qū)域加用利多卡因局部麻醉。顱骨處脫毛備皮，常規(guī)消毒。制備10cm長矢狀切口，使用直徑為8mm環(huán)形鉆(Straumman Co,Switzerland)制備4個骨缺損(直徑8mm，深4mm)，參照文獻[5]。(圖1a)各個孔之間間隔1cm。在缺損中心植入準備好的直徑3.1mm、長10mm的純鈦種植體，種植體下部4mm與周圍骨緊密接觸以保證種植體初期穩(wěn)定，而上部4mm與骨質(zhì)間形成環(huán)形間隙，形成種植體周圍骨缺損模型。(圖1b)然后把準備好的膠原海綿放入種植體周圍環(huán)形間隙處，實驗組在骨缺損區(qū)置入BMP2/7異源二聚體蛋白或BMP2、BMP7同源二聚體蛋白和膠原海綿復合材料，對照組僅置入膠原海綿。

圖1 小型豬顱骨種植體周骨缺損模型及使用膠原海綿吸附BMPS示意圖(a)使用環(huán)形鉆制造骨缺損(直徑8mm，深度4mm)，種植體(直徑3.3mm，長度8mm)植入缺損中心，4mm植入骨內(nèi)(b)種植體周骨缺損處使用膠原海綿填充(吸附或不吸附BMPS)，并在縫合前使用Bio-GideR○膜覆蓋

這樣缺損處局部BMP濃度為30ng/mm3。最后缺損上部蓋上40mm×50mm Bio-Gide膠原膜(Geistlich蓋氏制藥公司，瑞士)以阻止周圍纖維結締組織的長入。骨膜及皮膚完全復位后嚴密縫合。常規(guī)使用青霉素(50000U/kg)預防感染。

1.2 標本制備及大體觀察 在種植體植入后2周、3周、6周時間段處死小型豬(每個時間點處死動物6只)。切開小型豬顱骨處皮膚，暴露顱骨，可見所植入種植體均較穩(wěn)固，無種植體松動脫落發(fā)生。取含種植體的組織塊，10%甲醛固定后，沿種植體長軸縱剖為兩半，然后置于10%EDTA液內(nèi)脫鈣2-4周。常規(guī)梯度乙醇脫水，石蠟包埋，制備厚度為4mm的連續(xù)石蠟切片。

1.3 免疫組化染色及結果分析 用EnVision兩步法及胰酶消化法修復抗原。石蠟切片分別經(jīng)歷二甲苯脫蠟、無水乙醇、95%、80%、70%乙醇脫水。然后在蒸餾水漂洗后使用胰酶消化8min。再次用蒸餾水漂洗，PBS漂洗5min×3次，浸入3%H2O2溶液內(nèi)阻斷內(nèi)源性過氧化物酶10min，再次PBS漂洗5min×3次，滴加適當比例稀釋后的一抗，37℃下孵育60min。實驗所使用骨鈣素抗體為Abcam公司提供(骨鈣素：Abcam,ab13418)，稀釋度為1∶400。孵育后再次PBS沖洗5min×3次，滴加小鼠IgG抗體-HRP多聚體，37℃孵育30min，PBS沖洗5min×3次。加入DAB顯色液顯色3min，顯微鏡下控制反應，自來水沖洗終止反應。采用Harris蘇木素液復染細胞核1min，95%、100%乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

采用Image-pro plus 6.0軟件對結果進行分析。陽性表達程度與IOD值正相關。

1.4 統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，使用SPSS17統(tǒng)計分析軟件進行重復方差分析和t檢驗。檢驗水準以P＜0.05具有統(tǒng)計學意義。

2.結果

骨鈣素在成骨細胞、骨細胞中均有表達。3周時表達最強。見圖2。在2，3，6周，BMP27組均較BMP2，BMP7組及對照組表達強。在各個時間點，三組均較對照組表達強。四組骨鈣素表達的IOD值比較見附表。

圖2 四個實驗組分別在種植體植入后3周骨缺損周圍新形成骨組織骨鈣素表達。 箭頭提示陽性表達成骨細胞

3.討論

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)是一組具有高度保守結構的二聚體蛋白，體內(nèi)外實驗及臨床試驗證實BMP2、BMP7同源二聚體(簡稱同聚體)在誘導異位成骨、修復骨缺損、促進脊椎融合、加速骨聯(lián)合等方面有顯著作用。但高達毫克級的有效劑量使得BMP同源二聚體的臨床應用面臨瓶頸。1990年，Sampath等首次報道了BMP2／7異源二聚體，其后研究報道指出BMP異源二聚體較BMP同源二聚體有更高效的誘導成骨作用[6]。

附表 四實驗組在2,3,6周的骨鈣素IOD值()

附表 四實驗組在2,3,6周的骨鈣素IOD值()

(*p＜0.05指與對照組相比有統(tǒng)計學意義；a,bp＜0.05分別指與BMP2，BMP7相比有統(tǒng)計學意義；c,dp＜0.05指與2,3周數(shù)值相比有統(tǒng)計學意義)

有研究發(fā)現(xiàn)xBMPs蛋白與膠原載體混合形成復合體植入大鼠皮下組織中，三周后鈣含量檢測提示1μg的xBMP4/7可以顯著增加鈣含量，而xBMP2或xBMP7則需要10μg才能顯著起效[7]。同樣是異位成骨，BMP2/7誘導骨形成的能力是BMP2的5-10倍，僅0.04μg的植入量就能在組織學上檢測到的骨形成，而BMP2至少要0.2μg；但隨著BMPs濃度的升高，至25μg時，同、異聚體之間的差異逐漸減少，甚至無明顯差異[8]。這一結果表明BMP異聚體并非在任何濃度范圍內(nèi)都具有優(yōu)勢，尤其是在高濃度時，異聚體的作用與同聚體相近或者相當。

本課題組建立了小型豬種植體骨缺損模型，采用硬組織切片與MicroCT研究發(fā)現(xiàn)在較低濃度時(30ng/mm3)BMP2/7較BMP2，BMP7能更有效刺激新骨形成(研究結果另行發(fā)表)。本研究中，我們采用免疫組化方法進一步研究BMP2/7、BMP2及BMP7誘導新骨形成過程中骨鈣素的表達。

本實驗建立了小型豬種植體骨缺損模型，選用顱骨作為研究對象，由于以下原因：1.小型豬顱骨比較平坦，有足夠?qū)挾炔⑶覜]有重要血管通過。2.顱骨的新生代謝類似于人。3.顱骨比口腔內(nèi)理化條件可控，可以避免種植失敗。同時小型豬顱骨與牙槽骨相比也有一些缺陷：如無法模擬類似口腔內(nèi)的微環(huán)境，顱骨骨質(zhì)與牙槽骨結構性能不一致，小型豬顱骨中央骨硬度較周邊大等。

以往報道未見誘導小型豬顱骨缺損BMP的最低有效劑量，試劑說明書中BMP2的推薦劑量是400ng/mm3。有報道稱BMP2在小鼠顱骨極限骨缺損模型中有效誘導劑量是30-240ng/mm3[9]，而在我們之前的體外實驗中我們發(fā)現(xiàn)BMP2/7的起效濃度顯著低于BMP2和BMP7，因此我們選用了30ng/mm3濃度作為研究濃度。

本實驗成功建立了小型豬顱骨極限骨缺損模型。極限骨缺損模型最早由Hollinger and Schmitz定義：即單憑動物自身修復不能達到完全新骨修復的骨缺損[10,11]。其后有很多研究對動物模型的種類，年齡，缺損部位，大小進行了研究。Schlegel等[12]在豬顱骨上建立了10×10 mm大小的骨缺損并進行了相關組織學研究。Park等也成功建立了種植體周圍的骨缺損模型[5]。本實驗在Park基礎上進行建模。

本實驗在小型豬種植體周骨缺損模型上使用BMP2/7異源二聚體及BMP2、BMP7同源二聚體促進骨再生，采用免疫組化方法對2、3、6周時新骨中骨鈣素表達進行了研究。骨鈣素是由成骨細胞和成牙本質(zhì)細胞特異合成和分泌的一種非膠原蛋白,是構成骨基質(zhì)的成分之一[13]。骨鈣素的生理功能主要有：保持骨的正常礦化；對破骨細胞前體具有誘導趨化作用,調(diào)節(jié)礦化及成骨過程[14]。骨鈣素主要沉積于礦化組織的細胞外間質(zhì)，對鈣和羥基磷灰石具有較高的親和力，并發(fā)揮骨代謝方面的作用。

本實驗對骨鈣素在BMP誘導種植體周圍成骨過程中的表達進行了研究，參考[LU1]Schwarz[15]及Hu Z[16]等動物實驗報道，選擇種植體植入后骨改建活躍期第2、第3周,及相對穩(wěn)定期第6周為觀察點。實驗發(fā)現(xiàn)：在各實驗組中，骨鈣素在2周就能檢測到表達，在3周時表達達到最高值，在6周時表達逐漸下降。在2、3、6周，BMP2/7組骨鈣素表達均顯著強于BMP2、BMP7同源二聚體組及對照組。在2、3、6周，BMP2組與BMP7同源二聚體組骨鈣素表達均顯著強于對照組；BMP2組與BMP7組之間沒有顯著差異。Schwarz等[15]對植入狗頜骨的種植體周圍組織的骨鈣素表達進行了研究，發(fā)現(xiàn)在SLA處理的種植體中，骨鈣素在術后4天開始表達，在7天、14天增加較快，趨勢與本實驗一致。

本實驗結果與課題組之前的體外細胞學實驗所取得結果相互呼應，即以10～150ng/ml濃度的rhBMP2/7、BMP2、BMP7刺激 MC3T3-E1細胞，并檢測OCN基因表達，同樣發(fā)現(xiàn)rhBMP2/7在1天和4天觀察點OCN基因表達顯著強于BMP2 和 BMP7 組[4]。

目前已有不少研究證實BMP2/7異源二聚體能夠有效的誘導骨再生，但成骨的具體過程及機制仍不明了，本研究發(fā)現(xiàn)在以同樣較低濃度作用與小型豬種植體周骨缺損誘導新骨形成過程中，BMP2/7異源二聚體較BMP2、BMP7同源二聚體有效促進骨鈣素的表達。下一步工作將繼續(xù)探討B(tài)MP2/7成骨過程中相關因子表達規(guī)律及成骨機制探討。

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