Bmi-1 mRNA在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)及其生物學(xué)意義

馮 云，盧秀波，詹菊輝，李軍紅，周會(huì)行，李振宇，程維剛，靳夢(mèng)林，賀 亮，邱正倫

(1洛陽市中心醫(yī)院，河南洛陽471000;2鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

研究表明Bmi-1作為一種廣泛表達(dá)核蛋白在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用，同時(shí)是預(yù)測(cè)預(yù)后的一個(gè)分子指標(biāo)［1］。文獻(xiàn)報(bào)道Bmi-1在多種腫瘤中高表達(dá)［2～4］，被認(rèn)為是一種癌基因。然而，關(guān)于 Bmi-1 與甲狀腺乳頭狀癌的關(guān)系目前國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)Bmi-1在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)，并研究其與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征關(guān)系，加深對(duì)甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生分子機(jī)制的理解。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2008年1月～2010年7月在洛陽市中心醫(yī)院和鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院甲狀腺乳腺外科住院治療的甲狀腺乳頭狀癌患者51例，男17例、女34例，年齡28～72歲、平均53歲。根據(jù)AJCC癌癥分期手冊(cè)中的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期33例，Ⅲ～Ⅳ期18例。微小癌10例，濾泡乳頭型11例，高細(xì)胞型11例，嗜酸細(xì)胞型1例，彌漫硬化型9例，包裹型9例。發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例。選取同期住院手術(shù)證實(shí)為甲狀腺腫標(biāo)本及瘤旁正常組織22例作為對(duì)照組，年齡36～57歲、平均48歲。所有病例術(shù)前均未接受放療、化療及激素治療，病歷資料完整。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 標(biāo)本收集與處理 標(biāo)本一次取材約200mg，立即放入-80℃冰箱保存，其余組織送常規(guī)病理檢查確診。

1.2.2 主要試劑及儀器 總RNA分離試劑TRIzol試劑購自Gibco公司，RT-PCR試劑盒購自TaKaRa大連寶生物工程有限公司，Bmi-1、GAPDH引物均由北京賽百盛公司合成，低溫高速離心機(jī)購自德國Hettich公司，PCR擴(kuò)增儀購自 BIO-RAD，UV-3200型紫外分光光度計(jì)為日本島津公司產(chǎn)品，IBAS2.5全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)為德國Kontron公司產(chǎn)品。

1.2.3 組織RNA抽提 按照TRIzol試劑盒說明書抽提組織總RNA，DEPC水溶解，-80℃凍存。

1.2.4 cDNA合成 應(yīng)用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，每份組織取3 μl總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為20 μl。按照說明書加入各項(xiàng)試劑混勻后置37℃水浴1 h，95℃ 5min終止反應(yīng)。終產(chǎn)物cDNA-20℃保存。

1.2.5 PCR反應(yīng) 按試劑盒說明進(jìn)行。反應(yīng)體系:10 × Buffer 2.5 μl，dNTP 2.5 μl，TaqDNA 聚合酶0.5 μl，上、下游特異引物各1 μl，模板1.5 μl，DEPC處理ddH2O水補(bǔ)足25 μl，混勻，離心。Bmi-1引物序列為 5'-ATGCATCGAACAACGAGAACT-3'和 3'-TCAACCAGAAGAAGTTGC-5'，片段長度為 269 bp。反應(yīng)條件:預(yù)變性94℃ 5min，變性94℃ 30 s，退火55℃ 30 s，延伸72℃ 45 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。β-actin引物序列:p3 5'-CCATGGAGAAGGCTGGGG-3'，p45'-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3'，片段長度為 377 bp。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所得數(shù)據(jù)百分率比較采用 χ2檢驗(yàn)。以P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 Bmi-1 mRNA在不同甲狀腺組織中的表達(dá)見圖1。Bmi-1 mRNA在甲狀腺乳頭狀癌組、良性組和正常組中的表達(dá)量分別為6.237±0.535、2.112±0.107和 2.266±0.156，F(xiàn)=1221.61，P ＜0.01;甲狀腺乳頭狀癌組高于良性組(t=40.70，P＜0.01)和正常組(t=39.01，P ＜0.01)。

圖1 Bmi-1 mRNA在不同甲狀腺組織中的表達(dá)

2.2 Bmi-1 mRNA表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 ①性別:Bmi-1 mRNA在男性患者和女性患者中陽性率分別為58.9%(10/17)和50.0%(17/34)，χ2=0.354，P=0.552。②年齡:Bmi-1 mRNA在＜45歲和≥45歲患者中陽性率分別為 42.9%(9/21)和 60.0%(18/30)，χ2=2.212，P=0.137。③病理類型:Bmi-1 mRNA在微小癌中陽性率為60.0%(6/10)，濾泡乳頭型癌為54.5%(6/11)，高細(xì)胞型癌為54.5%(6/11)，嗜酸細(xì)胞型癌為0，彌漫硬化型癌為44.4%(4/9)，包裹型癌為55.5%(5/9)，P=0.981。④分期:Bmi-1 mRNA 在Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期中陽性率分別為48.5%(16/33)和61.1%(11/18)，χ2=0.745，P=0.388。⑤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移:Bmi-1 mRNA在有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性率分別為 78.9%(15/19)和37.5%(12/32)，χ2=8.220，P=0.004。

3 討論

Bmi-1基因?qū)儆诙嗍峄蚣易宄蓡T(PcG)，為較早發(fā)現(xiàn)的哺乳類動(dòng)物PcG成員，其家族成員包括Bmi-1、Mel-18、BLG 等一系列保守且重要的蛋白［5］，人類Bmi-1基因定位于10號(hào)染色體短臂13區(qū)，其cDNA長3 202 bp，ORF編碼一個(gè)含326個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)含有一個(gè)位于N末端的環(huán)指結(jié)構(gòu)域(RF)和位于中心保守DNA結(jié)合模序螺旋—轉(zhuǎn)角—螺旋—轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)域，正是這兩個(gè)區(qū)域?qū)?xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤形成具有重要作用［6］。在胚胎期Bmi-1對(duì)哺乳動(dòng)物的骨骼、造血及神經(jīng)發(fā)育發(fā)揮重要作用，而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，高表達(dá)Bmi-1的腫瘤細(xì)胞被認(rèn)為是腫瘤中存在的“癌癥干細(xì)胞”［7］。因此Bmi-1基因的發(fā)現(xiàn)為腫瘤的發(fā)病機(jī)制、臨床病理聯(lián)系及判斷預(yù)后提供了一個(gè)新思路。

本研究首次報(bào)道甲狀腺乳頭狀癌中Bmi-1 mRNA表達(dá)顯著高于良性及正常組織，提示甲狀腺乳頭狀癌組織中存在Bmi-1基因高表達(dá)現(xiàn)象。本研究還顯示，Bmi-1高表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而與患者年齡和性別無關(guān)，提示Bmi-1高表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移有關(guān)，有可能成為甲狀腺乳頭狀癌早診和預(yù)后判斷的候選標(biāo)志物。

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