不同液體復(fù)蘇對(duì)休克產(chǎn)兔急性肺損傷的影響

林勝謀，王晨虹*，周 洲，盛 超，林賽穆

(1深圳市婦幼保健院，深圳518028;2南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院;3深圳市第四人民醫(yī)院)

產(chǎn)后出血是嚴(yán)重的分娩期產(chǎn)科并發(fā)癥，機(jī)體持續(xù)的失血將導(dǎo)致組織缺氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)障礙、細(xì)胞功能受損，誘發(fā)炎癥細(xì)胞產(chǎn)生和釋放細(xì)胞因子，引起微循環(huán)的功能和結(jié)構(gòu)改變，加重缺血—再灌注障礙，出現(xiàn)急性肺損傷(ALI)等并發(fā)癥。失血性休克治療過程中，補(bǔ)充血容量是提高心排血量和改善組織灌流的根本措施;由于產(chǎn)后出血多發(fā)生在胎兒娩出后24 h內(nèi)，機(jī)體剛經(jīng)歷了分娩所致的循環(huán)和凝血系列變化，此時(shí)何種溶液能有效的降低產(chǎn)后出血所致ALI的炎癥損傷，目前研究不多。2007年6月～2009年7月，本研究擬通過實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，探討不同溶液復(fù)蘇對(duì)休克產(chǎn)兔發(fā)生ALI炎癥反應(yīng)變化的差異，為臨床治療產(chǎn)后出血提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 24只新西蘭孕兔由南方醫(yī)院動(dòng)物中心提供，年齡1～1.5歲，妊娠期為15～25 d，體質(zhì)量2.5～3.5 kg，孕兔產(chǎn)后24 h行休克復(fù)蘇試驗(yàn)。

1.2 動(dòng)物模型 以3%戊巴比妥鈉(1 ml/kg)耳緣靜脈注入，動(dòng)物麻醉后游離雙側(cè)頸總動(dòng)脈及頸總靜脈，留置導(dǎo)管，制作產(chǎn)兔失血性休克模型。實(shí)驗(yàn)分為基礎(chǔ)期、休克期、復(fù)蘇期3個(gè)階段:①基礎(chǔ)期:即失血前期(或產(chǎn)后期);②休克期(0～60min):頸靜脈放血，速率2 ml/(kg·min)，使平均動(dòng)脈壓(MAP)在15min內(nèi)降至40 mmHg，維持其在40～45 mmHg 45min;③復(fù)蘇期(60～240min):當(dāng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至60min后，縫扎血管徹底止血，開始采用不同的液體復(fù)蘇方案(詳見實(shí)驗(yàn)分組)，維持MAP在80 mmHg，復(fù)蘇期持續(xù)3 h后處死動(dòng)物，取肺組織做相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物編號(hào)隨機(jī)分為4組，每組6只:①假休克組(SS);給予麻醉，插管處理后，但未進(jìn)行放血和任何治療。②生理鹽水復(fù)蘇組(NS):復(fù)蘇期接受小量生理鹽水(0.9%氯化鈉溶液，4 ml/kg)及林格氏液輸注以維持MAP在80 mm-Hg左右;③羥乙基淀粉復(fù)蘇組(HES):復(fù)蘇期接受小量羥乙基淀粉(4 ml/kg)及林格氏液輸注以維持MAP在80 mmHg左右;④高滲鹽水復(fù)蘇組(HS):復(fù)蘇期接受小量高滲鹽水(7.5%氯化鈉溶液，4 ml/kg)及林格氏液輸注以維持MAP在80 mmHg左右。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 樣本采集 分別于放血前(0min)、休克期末(60min)、復(fù)蘇期間(150min)以及復(fù)蘇期末(240min)4個(gè)時(shí)間點(diǎn)采血測(cè)定TNF-α、IL-10;取動(dòng)物肺組織檢測(cè)丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、髓過氧化物酶(MPO)、核因子-κB(NF-κB)活性、干濕質(zhì)量比(DW/WW)和細(xì)胞間黏附因子1(ICAM-1)mRNA表達(dá)。

1.4.2 TNF-а、IL-10檢測(cè) 用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清中TNF-а、IL-10含量，按操作流程加樣，終止反應(yīng)后，選擇450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度OD值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后，根據(jù)血清樣品的OD值計(jì)算TNF-а、IL-10 濃度。

1.4.3 MDA、SOD測(cè)定 采用改良硫代巴比妥酸(TBA)微量法檢測(cè)MDA含量，用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性;肺組織勻漿蛋白以考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行定量。

1.4.4 MPO測(cè)定 取低溫保存的肺組織100mg，通過H2O2法檢測(cè)肺組織勻漿MPO活性。

1.4.5 肺DW/WW測(cè)定 新鮮肺組織以120℃烘烤至恒重，根據(jù)“(濕重-干重)/濕重”公式計(jì)算肺水含量。

1.4.6 檢測(cè)NF-κB活性 支氣管肺泡灌洗液以BPS洗滌離心后，用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)沉淀細(xì)胞2～3 h，收集貼壁的巨噬細(xì)胞(PAM)接種于24孔培養(yǎng)板孵育4～5 h，提取PAM中核蛋白，并用凝膠電泳遷移率法測(cè)NF-κB活性。

1.4.7 ICAM-1 mRNA檢測(cè) 按AGPC法提取肺組織總RNA，以RT-PCR法檢測(cè)ICAM-1 mRNA。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳、紫外燈觀察結(jié)果并拍照，并經(jīng)圖像分析處理;以目標(biāo)條帶OD與內(nèi)參照光密度比值代表mRNA的量，OD=條帶平均光密度×條帶面積。

1.5 病理學(xué)檢查 光鏡下觀察各組肺臟的病理改變。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，各測(cè)量值以±s表示，每組不同時(shí)間點(diǎn)比較用重復(fù)測(cè)量方差分析，多重比較采用SNK檢驗(yàn)法，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同液體復(fù)蘇休克產(chǎn)兔過程中血清TNF-α、IL-10變化 見表1、2。

2.2 不同液體復(fù)蘇休克產(chǎn)兔后肺組織NF-κB活性、ICAM-1 mRNA的差異 見表3。

2.3 不同液體復(fù)蘇休克產(chǎn)兔后肺組織MDA、SOD、MPO以及DW/WW的差異 見表4。

2.4 不同液體復(fù)蘇休克產(chǎn)兔后肺組織病理變化SS組肺組織病理HE染色顯示大致正常。NS組顯示肺間質(zhì)水腫，肺泡隔明顯增寬伴中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡內(nèi)可見大量蛋白質(zhì)水腫液及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。HES組肺組織病理?yè)p傷與NS組大致相同。HS組肺組織病理?yè)p傷較NS組與HES組減輕，肺泡隔輕度增寬伴中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡內(nèi)可見少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。見插頁(yè)Ⅲ圖16。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)血清TNF-α的變化(±s，n=6)

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)血清TNF-α的變化(±s，n=6)

注:與同組休克前比較，*P＜0.05;與NS組、HES組同時(shí)間點(diǎn)比較，△P＜0.05

組別 TNF-α 0min 60min 150min 240min SS組100.7±5.7 97.6±3.8 101.4±6.6 99.5±6.2 NS組 97.5±5.3 227.5±13.6* 294.2±19.3* 270.6±18.5*HES組 101.3±6.4 230.2±14.2* 291.4±17.5* 267.7±16.9*HS組 98.8±5.5 232.6±14.8* 276.5±15.8＊△ 236.2±13.4＊△

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)血清IL-10的變化(±s，n=6)

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)血清IL-10的變化(±s，n=6)

注:與同組休克前比較，*P＜0.05;與NS組、HES組同時(shí)間點(diǎn)比較，△P＜0.05

組別IL-10 0min 60min 150min 240min SS組44.3±3.9 42.8±2.5 43.8±3.2 42.7±3.7 NS組 41.7±3.1 112.4±6.8* 152.8±11.0* 132.4±8.8*HES組 41.2±2.8 108.8±6.1* 148.6±10.3* 130.6±7.9*HS組 43.1±2.7 117.2±7.3* 126.5±8.9＊△ 109.6±7.8＊△

表3 各組肺組織細(xì)胞NF-κB活性、ICAM-1 mRNA 的差異(±s，n=6)

表3 各組肺組織細(xì)胞NF-κB活性、ICAM-1 mRNA 的差異(±s，n=6)

注:與SS組比較，*P＜0.05;與NS組、HES組比較，△P＜0.05

組別 NF-κB OD(450 nm) ICAM-1/GAPDH(%)SS組0.25±0.08 1.1±0.2 NS組 0.87±0.26* 4.8±1.4*HES組 0.81±0.24* 4.4±1.1*HS組 0.58±0.19＊△ 3.2±0.8＊△

表4 各組肺組織MDA、SOD、MPO、DW/W 的差異(±s，n=6)

表4 各組肺組織MDA、SOD、MPO、DW/W 的差異(±s，n=6)

注:與SS組比較，*P＜0.05;與NS組、HES組比較，△P＜0.05

組別MDA(mmol/mgprot)SOD(U/mgprot)MPO(U/L)DW/WW SS組12.6±1.7 194.0±13.6 1.16±0.22 0.116±0.008 NS組 54.6±6.0* 44.5±5.6* 4.77±0.89* 0.203±0.029*HES組 51.2±5.6* 48.2±6.1* 4.15±0.78* 0.187±0.023*HS組 35.4±3.8＊△ 65.7±9.4＊△ 3.08±0.53＊△ 0.134±0.015＊△

3 討論

在產(chǎn)后出血所致ALI的發(fā)生發(fā)展過程中，除炎癥細(xì)胞外，炎癥介質(zhì)的參與對(duì)啟動(dòng)和維持炎癥反應(yīng)起著重要的作用。TNF-α是具始動(dòng)和關(guān)鍵性作用的促炎免疫因子，其引起ALI的機(jī)制主要有:與肺組織TNF-α受體結(jié)合，使溶酶體受損，導(dǎo)致酶外泄引起肺損傷;刺激內(nèi)皮細(xì)胞與中性粒細(xì)胞(PMNs)黏附，后者釋放蛋白酶、氧自由基等大量介質(zhì)發(fā)揮毒性作用;刺激單核巨噬細(xì)胞合成、釋放IL-1β、IL-6及IL-8等細(xì)胞因子及黏附分子，進(jìn)一步促使PMNs趨化，構(gòu)成炎性損傷的級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)［1］。而IL-10則是具有抗炎功能和免疫抑制效應(yīng)的炎癥介質(zhì)［2］，具有明顯對(duì)抗PMNs等炎癥細(xì)胞在肺組織中浸潤(rùn)的作用，從而減輕ALI的發(fā)生。

本研究產(chǎn)兔發(fā)生失血性休克等創(chuàng)傷后，機(jī)體出現(xiàn)炎癥反應(yīng)激活，TNF-α、IL-10均增高，提示炎癥反應(yīng)在高水平臺(tái)階進(jìn)行，且血清炎癥應(yīng)答存在時(shí)限性，應(yīng)答高峰出現(xiàn)在休克后第250min。比較不同溶液的復(fù)蘇效應(yīng)，在休克復(fù)蘇后150min、240min時(shí)間點(diǎn)，HS組 TNF-α、IL-10均低于 NS組與 HES組，提示高滲鹽水能顯著減少炎癥反應(yīng)中炎癥因子的產(chǎn)生，效果較羥乙基淀粉與生理鹽水更為明顯。

在各種致病因素所導(dǎo)致的ALI中，缺血再灌注損傷與機(jī)體炎癥應(yīng)答是重要的發(fā)生機(jī)理，兩者相輔相成構(gòu)成了炎癥“瀑布效應(yīng)”和組織細(xì)胞損傷。聯(lián)合檢測(cè)SOD、MDA，反映了缺血再灌注時(shí)體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生和清除水平，其含量可間接了解肺組織缺血再灌注損傷程度［3］。而PMNs是機(jī)體發(fā)揮正常防御和免疫功能不可缺少的一種炎癥細(xì)胞。在創(chuàng)傷、休克等情況下，PMNs在肺內(nèi)聚集、激活，并通過“呼吸爆發(fā)”釋放氧自由基、蛋白酶和炎癥介質(zhì)，引起肺組織急性炎癥損傷。MPO是中性粒細(xì)胞所特有的還原酶，測(cè)定肺組織MPO可判斷PMNs的活化程度。

與其他病因類似，產(chǎn)后出血所致ALI的炎癥應(yīng)答程度受眾多因素調(diào)節(jié)，NF-κB與ICAM-1便是重要的兩個(gè)方面。NF-κB是一種核轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控重要的細(xì)胞因子、黏附分子和趨化因子以及參與炎癥反應(yīng)放大與延續(xù)的多種酶的轉(zhuǎn)錄，在啟動(dòng)免疫應(yīng)答、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［4，5］。同時(shí)，炎癥激活時(shí)，巨噬細(xì)胞通過TNF-α刺激肺血管內(nèi)皮細(xì)胞表面間黏附因子ICAM-1表達(dá)上調(diào)，參與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)［6］。

本研究產(chǎn)兔發(fā)生失血性休克后，肺組織MDA、MPO、ICAM-1及NF-κB活性顯著升高，SOD明顯降低，提示炎癥在應(yīng)答水平及調(diào)控水平均激活。比較不同溶液的復(fù)蘇效應(yīng)顯示，高滲鹽水能減輕產(chǎn)兔肺組織的炎癥應(yīng)答，與非產(chǎn)后動(dòng)物模型有類似保護(hù)效應(yīng)［7］。具體表現(xiàn)在:①在信號(hào)轉(zhuǎn)錄水平，NF-κB介導(dǎo)炎癥刺激活性降低;②肺組織的ICAM-1細(xì)胞黏附分子表達(dá)減少，減少了PMNs滯留于肺微血管和組織間隙;③肺組織細(xì)胞MPO減少，提示PMNs的活化程度降低;④肺組織SOD活性增強(qiáng)，增強(qiáng)了清除氧自由基的能力;⑤脂質(zhì)過氧化物及其降解產(chǎn)物MDA減少。產(chǎn)兔分子生物學(xué)的改變?cè)诜谓M織病理上同樣得到了證實(shí)，HS組ALI出現(xiàn)間質(zhì)水腫程度和炎癥浸潤(rùn)程度都較其他2組輕。

由于產(chǎn)后出血在產(chǎn)褥期并不罕見，研究液體復(fù)蘇的機(jī)制有重要的意義［8］。高滲鹽水復(fù)蘇產(chǎn)兔對(duì)ALI的保護(hù)機(jī)制目前尚不明確，但基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以下作用機(jī)理可能參與其中:①在動(dòng)員細(xì)胞內(nèi)液的同時(shí)擴(kuò)充了血漿容量和組織間液體容量，減少了缺血再灌注損傷;②通過 NF-κB調(diào)控機(jī)制，減少TNF-α等炎癥因子的產(chǎn)生或釋放，減輕炎癥應(yīng)答;③參與了對(duì)免疫功能和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，減少肺組織內(nèi)ICAM-1所誘發(fā)的PMNs聚集［7］，從而減輕了脂質(zhì)過氧化作用;④降低了PMNs的活化程度，提高了清除氧自由基的能力。

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