多胚亞麻種質(zhì)的研究與利用

康慶華 ，關(guān)鳳芝 *，吳廣文 ，徐 涵 ，黃文功 ，劉 巖 ，孫中義 ，張利國 ，吳建忠 ，姜衛(wèi)東，趙東升 ，程麗麗，宋喜霞

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，哈爾濱150086；2.法國圖盧茲綜合科學(xué)研究所，法國；3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，哈爾濱150086）

亞麻科有22個屬200多個種，生產(chǎn)上應(yīng)用的為栽培種亞麻（Linum usitatissimum L.），該種內(nèi)有極少部分種質(zhì)資源存在多胚性，稱為多胚亞麻，即在亞麻種子的一個胚珠中包含兩個或多個胚。早在1933年Kappert就對多胚亞麻進(jìn)行了研究，以后的大量文獻(xiàn)認(rèn)為單倍體植株的出現(xiàn)頻率在雙胞胎中顯著高于非雙生植株，并且在種子發(fā)芽后3-5d很容易鑒定，所以，利用多胚亞麻種質(zhì)資源作為單倍體的來源，成為亞麻育種的一個新方法。

1 多胚亞麻種質(zhì)的引進(jìn)與系選

1.1 多胚種質(zhì)引進(jìn)

俄羅斯是世界上開展亞麻多胚種質(zhì)資源研究和利用最早的國家。自20世紀(jì)70年代起，全俄亞麻研究所的Poliakov和他的同事（2010）對亞麻纖維型、中間型和油用型三個類別的125（個樣本）份種質(zhì)的600 000個種子進(jìn)行了海選和分析，篩選到208(0.034%)個能獲得雙生植株的種子，4個（0.0006%）獲得三株植株的種子，多胚率0.034%，且中間型和油用型概率更高。還認(rèn)為多胚種子的形成在一定程度上取決于基因型。篩選出 Садко、1288-12（俄羅斯）、Lintekx（加拿大）、Ninke（荷蘭）、Minerva、Cristal（美國）等具多胚的特征、雙生幼苗率0.05%～0.6%的種質(zhì)材料，而Светоч，Лазурный，Торжокский4（俄羅斯），к-7222，Тайга（法國）等材料的樣本數(shù)達(dá)到 10 000～16 000，才能發(fā)現(xiàn)雙生植物。后來育種者們利用這些材料通過雜交、物理化學(xué)等方法進(jìn)行了研究和利用，創(chuàng)造出一系列高多胚率的種質(zhì)材料和加倍單倍體品系。1993年，黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所從俄羅斯農(nóng)業(yè)科學(xué)院全俄亞麻研究所引入了3份多胚資源（D95029、D95030和D95031），開始了中國多胚亞麻種質(zhì)資源和育種的研究。

1.2 多胚種質(zhì)系選與多胚性保持

1994年，我所對3份引進(jìn)資源進(jìn)行了繁殖和多胚性鑒定。在起初的繁殖階段采用種子混收，由于這3份資源不是純系，多胚水平明顯下降，迄今在D95030和D95031中每10 000粒種子中，尚未發(fā)現(xiàn)多胚種子。為了保持和提高D95029的多胚水平，自2002年開始對其進(jìn)行了連續(xù)的多胚單株的系統(tǒng)選擇，目前已選出在株高、纖維含量及多胚水平等性狀表現(xiàn)不同的株系19個。品系選擇對該資源多胚水平的保持和提高以及今后的利用具有重要意義。

2 多胚亞麻種質(zhì)的創(chuàng)新

雜交可以促進(jìn)多胚現(xiàn)象在不同基因型間聯(lián)合、集中和擴(kuò)展。劉燕（1999）利用3份引進(jìn)的資源與具有不同遺傳基礎(chǔ)的資源雜交，H0代多胚檢測結(jié)果顯示，以D95029為母本的4個組合后代雙胚率為19.2%，以D95030為母本的3個組合后代的雙胚率為5.3%，以D95031為母本的3個組合后代的雙胚率為1.3%。隨后我所利用已系選的多胚資源，采用與幾乎不具有多胚性的材料以廣泛雜交的方式對引進(jìn)的多胚資源進(jìn)行改良和推廣，發(fā)現(xiàn)多胚率最高的一個組合H09052，F(xiàn)1代多胚率達(dá)50%。表1為2002年至2009年利用引進(jìn)的多胚資源所創(chuàng)造的亞麻育種材料的多胚情況。在多胚資源利用期間，還進(jìn)行了其雙生植株的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)上的研究。

表1 2002-2009年亞麻創(chuàng)新資源的多胚率Tab.1 Polyembryonic rate of the hybridized strains from 2002 to 2009

2.1 雙生亞麻植株的形態(tài)觀察

據(jù)俄羅斯的大量研究報道，多胚種子中形成的雙生植物，具有下列的組合，即單倍體－單倍體（n-n）、2n-n、2n-2n型雙胚，三胚、四胚很少見。2008年我所對15個樣本110個多胚種子的31對未死亡的多胚植株進(jìn)行了形態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)大多雙生苗中的大苗為二倍體可育，小苗為單倍體苗不能結(jié)實(shí)；有的雙生苗大小株型完全相同，但育性不同，有的大株不育小株可育；有的孿生株株高相同莖粗不同育性也不同，且都為2n－n型。有的雙株都可育，為2n－2n型。也有上述多種情況出現(xiàn)在同一組合內(nèi)的。既有二倍體-單倍體組合，也有二倍體-二倍體組合。在這31對雙生植株中未發(fā)現(xiàn)單倍體-單倍體組合。這31對雙生苗中出現(xiàn)26株單倍體苗，單倍體苗在雙生苗中出現(xiàn)的頻率為41.9%。

2.2 雙胚亞麻的細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)研究

目前，多胚亞麻的細(xì)胞學(xué)研究很少。我所以多胚亞麻材料D95029-18-3、D95029-8-3、D95029-8-1、1-6Ha的8粒雙胚種子形成的16株苗（以大、小區(qū)分每粒種子的2株苗）的根尖為檢測部位，采用醋酸洋紅和DAPI進(jìn)行染色體倍性觀察，發(fā)現(xiàn)D95029-18-3的第12號種子形成的小苗、1-6Ha的第23號種子形成的小苗的染色體為16條，為單倍體；觀察到D95029-8-1的21號種子形成的小苗、D95029-8-3的1號種子形成的大苗染色體在32條，鑒定為二倍體；其余苗沒有查到能鑒定出倍性的分裂相。通過對染色體的數(shù)目的檢測進(jìn)一步證明雙生苗中單倍體苗的存在。

目前有關(guān)亞麻多胚的分子生物學(xué)研究很少。本人從隨機(jī)選擇的70條RAPD引物和21條ISSR引物中篩選出的10條引物對品系1-6ha-3中的多胚種質(zhì)材料和其它23個不具多胚性的亞麻材料進(jìn)行聚類分析，試驗(yàn)結(jié)果顯示24份亞麻材料（見表2）在閾值為0.73處能被分為四大類，多胚材料1-6ha-3獨(dú)為第二類群，且與其他23個亞麻品種的遺傳相似系數(shù)分布在0.6522～0.7739之間（圖1），表明這份種質(zhì)材料與其他材料間都存在著較大的遺傳差異，為亞麻多胚性分子標(biāo)記的研究奠定了基礎(chǔ)。

表2 供試的24份亞麻材料Tab.2 24 materials of Linum usitatissmum L.for the experience

圖1 24個亞麻栽培品種的聚類分析Fig.4 Clustering analysis diagram of 24 cultivars of Linum usitatissmum L.

3 多胚亞麻遺傳、誘導(dǎo)和利用

3.1 亞麻多胚性的遺傳研究

多胚性是受基因控制的，因此可以遺傳。以往的研究資料表明多胚性是受多基因控制，因此俄羅斯進(jìn)行多胚遺傳研究時在雜交后代中發(fā)現(xiàn)了多胚遺傳的中間型。也有一些試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)基因的加性效應(yīng)影響著多胚現(xiàn)象的顯現(xiàn)。還有資料研究認(rèn)為多胚的遺傳同時受細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的密切作用影響（Poliakov，2010）。因此多胚性的遺傳比較復(fù)雜，有待進(jìn)一步研究。

在我們的試驗(yàn)中，對2006年的21個誘導(dǎo)多胚的雜交組合的F1和F2代進(jìn)行了多胚檢測，發(fā)現(xiàn)16個組合F2代多胚率高于F1代，5個組合F1代高于F2代。該試驗(yàn)關(guān)于多胚出現(xiàn)的概率在F1和F2代的變化情況與俄羅斯的研究結(jié)果不一致。

在被研究的21個雜交組合中，在H06127、H06140等的8個雜交組合F1和F2代中多胚出現(xiàn)率比其父母本具有明顯的優(yōu)勢，其它組合則出現(xiàn)中間性遺傳。導(dǎo)致第一代中多胚增加的原因目前還未能明確。但值得一提的是在種內(nèi)雜交的F1代種子雙生植物出現(xiàn)的頻率增加和伴隨著單倍體-二倍體植株形成的多胚種子明顯增加的現(xiàn)象，對于在育種實(shí)踐中的應(yīng)用具有重要意義。如，在H06128的雜交組合的F1代雜交種中發(fā)現(xiàn)了4對雙生植株，其中3對具有二倍體-單倍體組合組成；H06127的雜交組合的F1代雜交種中發(fā)現(xiàn)了14對雙生植株，其中10對具有二倍體-單倍體組合組成。所以在選擇這樣的雜交組合過程中在F1代種子中即可得到大量的單倍體植株。

3.2 多胚的誘導(dǎo)研究

目前關(guān)于多胚誘導(dǎo)方面的國內(nèi)研究資料極其有限。在亞麻方面我們主要是開展了選定的特定基因型間的雜交試驗(yàn)研究。

3.2.1 雜交誘導(dǎo)多胚

根據(jù)上面的研究，不難發(fā)現(xiàn)采用多胚率高的材料與無多胚性和多胚性極低的材料雜交，其后代在多胚性上很可能出現(xiàn)超親優(yōu)勢或出現(xiàn)多胚中間型。因此利用雜交是誘導(dǎo)多胚提高多胚率的有效方法。在研究中我們配置了能夠誘導(dǎo)出多胚的雜交組合500個，既這些雜交組合的親本至少有一個是具有多胚特性的材料。試驗(yàn)中我們得到了500多個雜交材料。通過分析雜交后代材料的多胚水平可知，以高多胚率的材料無論作父本還是母本，雜交后代都可能出現(xiàn)多胚現(xiàn)象，且親本的多胚水平越高，雜交后代的多胚出現(xiàn)的機(jī)率越大；雜交雙親都是具有高多胚率的材料，其雜交后代的多胚水平將明顯增加（見表3～表5）。從多胚性高的雜交后代中分離出一系列品系如H99007、H04052等，以組合的親本（母本或父本）形式與非多胚種子進(jìn)行雜交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，利用這些品系中的無論非多胚種子還是多胚的種子做親本（父本或母本）的雜交后代也都有多胚現(xiàn)象發(fā)生，但以多胚種子做親本的組合后代多胚發(fā)生頻率高，這與俄羅斯的研究結(jié)果一致。

表3 母本屬于多胚種質(zhì)的雜交組合后代中的多胚現(xiàn)象Tab.3 The polyembryonic Ratio of the polyembryonic female parental hybrid seeds

表4 父本屬于多胚種質(zhì)的雜交組合后代中的多胚現(xiàn)象Tab.4 The polyembryonic Ratio of the polyembryonic male parental hybrid seeds

表5 雙親都屬于多胚種質(zhì)的雜交組合后代中的多胚現(xiàn)象Tab.5 The polyembryonic Ratio of the polyembryonic parental hybrid seeds

3.2.2 外在因素誘導(dǎo)多胚

由于個別基因型的多胚發(fā)生情況在年際間表現(xiàn)相對不穩(wěn)定。所以外部條件對多胚誘導(dǎo)具有一定的影響。在我們的研究中，采用NAA噴施多胚材料，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有使多胚現(xiàn)象增加的趨勢，該研究還有待進(jìn)一步探索。

4 多胚亞麻育種存在的問題及建議

4.1 多胚性的保持

由前所述，多胚種質(zhì)資源在連續(xù)繁殖過程中，如果不注重保持和選擇，多胚水平將急速下降，多胚性將丟失。所以在多胚資源利用的同時，應(yīng)加強(qiáng)多胚性的保持。在保持多胚方面應(yīng)做好以下三個方面的工作：一是不斷地進(jìn)行篩選；二是不斷進(jìn)行雜交誘導(dǎo)；三是探索提高多胚率的外界因素。

4.2 多胚的基礎(chǔ)性研究

目前，有關(guān)多胚資源的基礎(chǔ)研究工作還相當(dāng)薄弱。多胚的基礎(chǔ)研究是多胚資源利用的關(guān)鍵。所以有待進(jìn)一步加強(qiáng)。一是要深入開展多胚胚胎發(fā)生學(xué)研究，為更好利用多胚提供理論基礎(chǔ)；二是要加深多胚的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究，以明確多胚遺傳規(guī)律和形成機(jī)理，為高效利用多胚資源提供保障。

4.3 多胚亞麻的創(chuàng)新利用

目前我們雖然已經(jīng)創(chuàng)建了一定的多胚亞麻資源基礎(chǔ)，但應(yīng)加快多胚資源的創(chuàng)新利用步伐。尤其是利用多胚雙生植株中的單倍體獲得的雙單倍體品系技術(shù)應(yīng)常規(guī)化應(yīng)用于亞麻育種，以達(dá)到快速固定雜種優(yōu)勢的目的，提高資源創(chuàng)新和育種效率。

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