三重處理法獲得大麻種子無菌苗研究

程超華，李育君，趙立寧，唐 蜻，臧鞏固

（中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所，長沙 410205）

大麻（Cannabis sativa）為大麻科大麻屬一年生草本植物，按其用途分為工業(yè)大麻、油用大麻和藥用大麻三類。工業(yè)大麻相關產(chǎn)品可用于造紙、化妝品、服裝、地毯、汽車、建筑、農(nóng)業(yè)、回收、食品等領域，多功能性使其在市場上有很強的競爭優(yōu)勢；油用大麻和藥用大麻也因其獨特性分別在食品和醫(yī)藥領域占有重要地位。大麻一般是雌雄異株，為異質結合體，同一群體內不同個體間表現(xiàn)多樣性，遺傳基礎復雜，其育種進程遠落后于其它植物。因此，利用生物技術手段對傳統(tǒng)育種方法進行改良和輔助，是推進大麻育種的有效方法。

離體培養(yǎng)是生物技術工作的基礎，目前大麻離體培養(yǎng)研究均采用野外生長的實生苗作為外植體。大麻生長周期短，外植體取材時期有限且難以消毒滅菌，是離體培養(yǎng)研究的瓶頸[4，6，7]。健壯的無菌苗是有效開展轉基因研究及其它組培實驗的基礎和關鍵。種子是獲得大麻無菌苗的主要途徑之一，因此，種子滅菌顯得尤為重要。但是，大麻種子結構復雜，內部攜帶大量的微生物，種皮堅硬，自然破殼萌芽時間長，波蘭研究者曾試驗用種子無菌苗獲得外植體，但因種子內生菌多，污染嚴重而放棄[10]。目前未見高效獲取大麻種子無菌苗研究的報道。本研究以大麻種子為材料，進行多種方法的滅菌處理，獲得了出苗率高、污染少的種子無菌苗培養(yǎng)方法，為大麻組織培養(yǎng)和遺傳轉化研究打下了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試品種為尤紗31，皖大麻，山西本地麻2號、汾麻3號。分別來自黑龍江和山西。

1.2 滅菌方式

選取飽滿、勻實種子，經(jīng)三個步驟進行種子滅菌處理：

（1）用98%工業(yè)硫酸浸泡20min后，于自來水下沖洗30min；

（2）用75%酒精浸洗2min；

（3）經(jīng)下述四種不同方式進行處理，接種于MS培養(yǎng)基上：

① 0.1%深汞浸泡20min后，用無菌水沖洗數(shù)次，于干凈濾紙上吸干水分，用手術刀和鑷子剝去種皮，接種于培養(yǎng)基上。

② 0.1%深汞浸泡20min后，用無菌水沖洗數(shù)次，于干凈濾紙上吸干水分，不剝種皮直接接種于培養(yǎng)基上。

③ 3%次氯酸鈉浸泡20min后，用無菌水沖洗數(shù)次，于干凈濾紙上吸干水分，用手術刀和鑷子剝去種皮，接種于培養(yǎng)基上。

④ 3%次氯酸鈉浸泡20min后，用無菌水沖洗數(shù)次，于干凈濾紙上吸干水分，不剝種皮直接接種于培養(yǎng)基上。

每一處理30個外植體，重復3次，3天后每天統(tǒng)計污染率和種子萌發(fā)情況。

為了試驗不同品種對滅菌處理的反應，分別取皖大麻，山西本地麻2號、汾麻3號按照處理③進行滅菌處理，3天后統(tǒng)計污染率與種子萌芽情況。

1.3 試驗結果的統(tǒng)計方法

參考王子成的方法[5]：

污染率=（污染外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100%；

未萌芽率=［（死亡個數(shù)+未萌芽數(shù)）/接種外植體數(shù)］×100%；

成功率=（萌芽不污染數(shù)/接種外植體數(shù)）×100%

這里，用未萌芽率代替殺死率，更能反映滅菌的負面影響。因為有一部分外植體雖未被殺死，但由于受到的傷害也較重，不能萌發(fā)，因而也不能進行繼續(xù)培養(yǎng)。所得數(shù)據(jù)用鄧肯氏新復極差法分析。

2 結果與分析

2.1 不同滅菌方法對污染率及種子萌發(fā)的影響

接種1天后，剝皮處理（③和①）的種子開始萌發(fā)，到第3天時長勢良好，可見深綠色子葉及小部分真葉，是用作組織培養(yǎng)的極佳材料，3天后萌發(fā)未見增多，可見3天是種子萌發(fā)生長及外植體取材的最佳時期。未剝皮處理（②和④）的種子則萌發(fā)啟動時間長，一周后才開始突破種皮，第10天時可見子葉和真葉。10天后萌發(fā)率未見增加。表1的結果表明，處理③的滅菌效果最好，成功率達到80.83%，污染率只有4.17%。處理①的成功率和污染率均顯著低于處理③，這可能是因深汞不能充分浸入種子內部對其內生菌進行滅殺。而且有可能己對種子內部造成傷害，影響其萌芽。處理②和④污染率極低，但因其萌發(fā)時間長，出芽率低。不適合用作獲取無菌苗。由上可見，處理③的消毒方法，即3%的次氯酸鈉處理種子后剝去種皮接種于培養(yǎng)基上，滅菌效果好，污染少，成功率高，是獲取無菌苗的最佳消毒方法。

表1 不同滅菌方法得到無菌苗的情況Table 1 Results ofdifferent hemp seeds with different disinfection protocols

2.2 種皮留存對污染率及種子萌發(fā)的影響

從表1可知，處理④和處理②的滅菌處理分別與③、①相同，但均未剝種皮接種于培養(yǎng)基上，雖然污染率極低，但出芽時間長且出芽率低。這是由于大麻種殼堅硬，培養(yǎng)基的理化條件不適合其自然萌芽，其在培養(yǎng)基中的萌芽時間明顯高于田間條件。對于要求快速、大量無菌苗作外植體的離體培養(yǎng)來說，超凈臺上剝去種皮雖然較難操作，但出苗時間和出苗數(shù)量卻明顯好于不剝種皮。

2.3 不同大麻品種污染率的差異

表2的結果表明，在用處理③的方法對不同品種大麻種子進行滅菌處理時，不同品種間的成功率和污染率存在著一定的差異，這可能與不同品種種子外表皮結構和內生菌攜帶量有關，也可能與不同材料對次氯酸鈉的耐受力有關。皖大麻經(jīng)滅菌以后，成功率最??；其它品種，經(jīng)滅菌后均有較高的成功率，其中汾麻3號最高，達到87.78%。所以，在對污染率較高的大麻品種進行滅菌處理時，可對現(xiàn)有方法進行適當改進調整，或者每瓶培養(yǎng)基盡量少接種種子，避免交叉污染，以便獲得更好的成功率。

表2 不同品種得到無菌苗的情況Table 2 Difference amonghemp cultivars on gaininggermfree seedlings bythree-step treatment

3 討 論

植物組織的離體培養(yǎng)技術是轉基因育種和體細胞突變技術育種的前提和基礎。種子無菌苗因能大量、便捷地產(chǎn)生離體培養(yǎng)所需的外植體（子葉、真葉、下胚軸）而被廣泛應用。因此，如何成功的對種子滅菌，縮短萌芽時間，獲得大量無菌苗，是進行生物技術研究的前提。

種子消毒方法得當與否是獲得無菌苗的關鍵，由于作物種子在其生長發(fā)育過程中易受自然界各種細菌和真菌的浸染，種子不僅表面帶菌，而且內部也可能被感染，所以對種子進行徹底的滅菌就非常重要。

一般常用的滅菌劑有：75%酒精、0.1%升汞、3%-4%次氯酸鈉等，其它抗菌素、雙氧水、硝酸銀、溴水等亦可采用。升汞是應用最廣泛的一種消毒劑，它殺菌力強，但刺激性和腐蝕性大，對金屬器皿有腐蝕作用，對人畜有劇毒。對細菌的滲透性小，遇有機物效果降低。升汞消毒后難以除去殘余汞對外植體的殺傷作用；而次氯酸鈉滅菌的原理是水解形成次氯酸，次氯酸再進一步分解形成新生態(tài)氧，新生態(tài)氧的極強氧化性使菌體和病毒上的蛋白質等物質變性，從而使病源微生物致死[3]。

迄今各種滅菌方法已有不少報道：如杜燕等曾對貯存過期油菜種子進行消毒處理研究，結果以10%NaClO處理較好[1]。張志飛等研究表明，適用于富含內生真茵的高羊茅種子的最佳消毒組合為50℃溫水浸泡10 min．再經(jīng)70%酒精處理5 min．然后用次氯酸鈉處理15 min，在保證較高種子發(fā)芽率的前提下，可降低種子污染率，提高出愈率[8]。

本研究中，大量易獲取的、不受取材時間限制的無菌苗為大麻組織培養(yǎng)提供了良好的基礎，該體系下獲得的無菌苗可以直接作為組織培養(yǎng)的外植體來源，無需進行再次消毒，我們的初步試驗表明，將這些外植體直接接種在培養(yǎng)基上可誘導出愈傷組織。

本研究建立的新的滅菌方法的優(yōu)點在于：一、用次氯酸鈉作為滅菌劑，處理以后殘毒能夠自然降解，避免了對環(huán)境的污染，因而優(yōu)于用升汞處理；二、用工業(yè)硫酸預處理種子，除去種子上附著的雜質，減少污染機率，軟化后種皮有利于下一步的剝皮操作。三、種子經(jīng)滅菌處理后，于超凈臺上人工剝去種皮，能大大加快種子萌芽速度，3-4天時間便能生產(chǎn)大批量無菌苗，快捷方便。至今，還沒有該方法的報道，我們將該方法命名為“三重處理法”。本研究建立的“三重處理法”不但解決了大麻種子滅菌不易的難題，而且對其它難滅菌材料，特別是種子堅硬，內生菌較多的種子的滅菌，也有一定的參考價值。但應該指出的是，不同種類的植物材料，同一植物不同成熟程度的材料，對滅菌劑的耐受力不同，在進行滅菌處理時，應該根據(jù)具體情況，決定滅菌處理的時間，以獲得較高的成功率[2]。

[1] 杜燕.蔣海玉.劉其寧.貯存過期油菜種子消毒方法的研究[J].種子，2003（02）：39-40.

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[3] 唐琳，劉建國，馬欣榮．兩種滅菌方法對番茄種子滅菌效果的評價[J]．種子，2008，27（9）：17-18．

[4] 佟金風，高南，李凝，等.大麻試管苗生根培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2008，36（33）：14438-14440.

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[8] 張志飛，饒力群.高羊茅種子內生真菌的消毒方法[J].草業(yè)科學，2008，25（6）：93-97.

[9] 張志元，官春云.油菜無菌苗培養(yǎng)前的種子消毒技術[J].中國油料作物學報，2005，（1）：88-91.

[10] Aurelia Slusarkiewicz-Jarzina，etc.ACTA BIOLOGICA CRACOVIENSIA Series Botanica[J].Influence of cltivar，explant source and plant growth regulator on callus induction and plant regeneration ofcannabis sativa L.2005，47（2）：145-151.