莼菜傳粉生物學(xué)及雜交技術(shù)研究

李雙梅 柯衛(wèi)東 葉元英 黃來春

（武漢市蔬菜科學(xué)研究所，湖北 武漢 430065）

莼菜（Brasenia schreberi J.F.Gmel）為睡蓮科（Nymphaeaceae）莼菜屬（Brasenia schreb.）多年生水生草本植物，蘇聯(lián)、日本、印度、美國、加拿大、大洋洲東部及非洲西部均有分布（中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會(huì)，1992）。研究莼菜的花器官結(jié)構(gòu)和傳粉系統(tǒng)對(duì)于雜交育種及種質(zhì)創(chuàng)新有著重要的意義。

近年來，部分國外學(xué)者對(duì)莼菜的研究日趨深入，在分子遺傳及花粉個(gè)體發(fā)育學(xué)等方面做了大量工作（Taylor & Osborn，2006；Kim et al.，2008），國內(nèi)學(xué)者在莼菜的解剖、加工、栽培、遺傳多樣性、胚胎學(xué)、細(xì)胞學(xué)及營養(yǎng)成分等方面研究較多（常福辰 等，1996；呂家龍 等，1996；丁春邦 等，1997；李煥秀 等，1997；施國新 等，1999；袁政 等，2007；張光富和高邦權(quán)，2008），而有關(guān)其傳粉生物學(xué)的研究鮮見報(bào)道。傳粉生物學(xué)是研究與傳粉有關(guān)的各種生物學(xué)特性及其規(guī)律的學(xué)科（黃雙全和郭友好，2000）。本試驗(yàn)以利川莼菜為材料，對(duì)花器官的結(jié)構(gòu)、開花習(xí)性、花粉的活力、柱頭可授性、傳粉方式等進(jìn)行研究，旨在揭示莼菜的開花傳粉習(xí)性，并提出莼菜人工雜交方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料

于2008年5月6日～6月10日對(duì)國家種質(zhì)武漢水生蔬菜資源圃的利川莼菜進(jìn)行觀測(cè)，觀測(cè)面積為1333 m2，正常田間管理。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 群體花期與開花習(xí)性 群體花期觀測(cè)：莼菜第1朵花開放的日期為始花期，50 %的莼菜水中莖開花的日期為盛花期，最后一朵花開放的日期為終花期，花期觀測(cè)面積為66.7 m2。

對(duì)于同一短縮莖上不同分枝抽生花芽的節(jié)位，隨機(jī)選取 10個(gè)完整的植株，分別記錄第 1分枝、第2分枝和第3分枝抽生花芽的起始節(jié)位。對(duì)于單個(gè)分枝開花朵數(shù)及同一分枝每朵花開放間隔的天數(shù)，隨機(jī)掛牌10個(gè)分枝，分別記錄每朵花開放的時(shí)間，最后統(tǒng)計(jì)開花朵數(shù)和開花間隔天數(shù)。

觀察單朵花的開花規(guī)律：隨機(jī)選取 10個(gè)剛現(xiàn)蕾的花掛牌標(biāo)記，每天觀察并記錄，直至花凋謝。觀察時(shí)記錄單朵花從現(xiàn)蕾到開花所需天數(shù)、開花天數(shù)、開花期間每天開放時(shí)間和閉合時(shí)間、雌雄蕊的伸長規(guī)律以及散粉時(shí)間等。

花器官性狀觀察：早上8:30隨機(jī)選取30朵第1天開放的花掛上標(biāo)簽，分別觀測(cè)花柄出水高度、萼片長/寬、花瓣長/寬、花藥長、花絲長、雌蕊長、花冠直徑、雄蕊數(shù)量和雌蕊數(shù)量。第 2天早上8:30再次對(duì)以上30朵花的器官性狀進(jìn)行觀測(cè)。

1.2.2 雜交指數(shù)（Outcrossing index，OCI）的估算 按照Dafni（1992）的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)花直徑及開花行為進(jìn)行觀測(cè)及繁育系統(tǒng)的評(píng)判。具體方法：① 花朵或花序直徑＜1 mm記為0；1～2 mm記為1；2～6 mm記為2；＞6 mm記為3。② 花藥開裂時(shí)間與柱頭可授期之間的時(shí)間間隔，雌雄蕊同熟或雌蕊先成熟記為0；雄蕊先成熟記為1。③ 柱頭與花藥的空間位置，同一高度記為0；空間分離記為1。①、②、③ 之和為OCI值。評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：OCI=0時(shí)，繁育系統(tǒng)為閉花受精；OCI=1時(shí)，繁育系統(tǒng)為專性自交；OCI=2時(shí)，繁育系統(tǒng)為兼性自交；OCI=3時(shí)，繁育系統(tǒng)為自交親和，有時(shí)需要傳粉者；OCI=4時(shí)，繁育系統(tǒng)為部分自交親和，異交，需要傳粉者。

1.2.3 同一分枝不同節(jié)位花自然結(jié)實(shí)的觀測(cè) 種子成熟期，隨機(jī)選取10個(gè)分枝，分別觀測(cè)不同節(jié)位花的花柄長、心皮數(shù)和結(jié)實(shí)數(shù)。

1.2.4 花粉生活力的測(cè)定（MTT法）與花粉/胚珠（P/O）估算 花粉生活力的測(cè)定：5月 30日選取10朵花，插入30 mL的試劑瓶（裝水）中，置于室內(nèi)20 ℃環(huán)境中，從散粉至衰?。? h、2 h、3 h、4 h、8 h、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、8 d、9 d、10 d、11 d）定期取花粉測(cè)定?；ǚ蹣悠分糜谳d玻片上，加1～2滴1 % MTT溶液，加蓋玻片后置于低倍鏡下觀察。每個(gè)制片觀察5個(gè)視野，共統(tǒng)計(jì)100粒左右，染成深紅色、紅色的花粉計(jì)為有活力，淺紅色、無色的計(jì)為無活力，計(jì)算花粉的活力百分率。3次重復(fù)，取平均值。

花粉/胚珠（pollen ovule ratio，P/O）估算：隨機(jī)選取即將開放的花蕾（花藥未開裂）20朵，固定于FAA中備用。剝開花瓣切下所有花藥，用1.0 mL·L-1HCl軟化花藥壁，解剖花藥，將全部花粉移入一個(gè)有刻度的離心管，仔細(xì)清洗花藥壁、鑷子和刀片，清洗液也移入離心管，定容至2 mL，振蕩器下振蕩60 s，制成花粉粒懸浮液，用微量進(jìn)樣器取2 μL花粉液于載玻片上，在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)花粉數(shù)，3次重復(fù)，取其平均值乘1000算出每個(gè)單花蕾的花粉?？倲?shù)（王英強(qiáng)等，2005）。接著將該花蕾的子房置于載玻片上于解剖鏡下解剖剝離，統(tǒng)計(jì)胚珠數(shù)。計(jì)算花粉/胚珠（P/O）。依據(jù)Cruden（1977）的劃分標(biāo)準(zhǔn)：P/O為18.1～39.0時(shí)，繁育系統(tǒng)為專性自交（Obligate autogamy）；P/O為31.9～396.0時(shí)，繁育系統(tǒng)為兼性自交（Facultative autogamy）；P/O為244.7～2588.0時(shí)，繁育系統(tǒng)為兼性異交（Facultative xenogamy）；P/O為2108.0～195525.0時(shí)，繁育系統(tǒng)為專性異交（Obligate xenogamy）。

1.2.5 人工套袋授粉 設(shè)6種授粉處理：自然授粉，去雄套袋，不去雄套袋，去雄不套袋，第1天開放花的異花人工授粉，第2天開放花的異花人工授粉。每個(gè)處理隨機(jī)選擇30朵花，采用白色硫酸紙袋套袋，統(tǒng)計(jì)不同處理的結(jié)實(shí)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 花部特征及開花習(xí)性

莼菜群體花期為5月初～6月初，主要集中在5月10～30日。完全花，花冠輪狀紅色，花瓣3枚，萼片3枚，雄蕊22～34枚，雌蕊6～12枚，單個(gè)子房胚珠數(shù)2個(gè)，一般一個(gè)胚珠發(fā)育成種子，另一個(gè)胚珠退化（所占比例92.8 %），極少數(shù)子房的2個(gè)胚珠都發(fā)育成種子（所占比例7.2 %）。

花一般在早上5:00～9:00陸續(xù)開放，10:00以后逐漸閉合，至12:00花全部閉合。莼菜雌雄同花，雌蕊先成熟。花開放第1天，花柄伸出水面，花被逐漸張開，并向外反卷，花剛開放時(shí)雌蕊高于雄蕊，雌蕊群緊密包合，后成輻射狀張開，柱頭上有細(xì)毛狀物，白色，利于接受花粉；此時(shí)，雄蕊群尚未成熟，花藥表皮呈紅色，不開裂，位于雌蕊柱頭之下。10:00以后，雌蕊合攏，花被逐漸收攏閉合，花梗微微彎曲。雄蕊在花閉合狀態(tài)下逐漸伸長，雄蕊的伸長主要是花絲的伸長，而花藥的長度變化不大。第2天花開放時(shí)，花梗再次挺立，此時(shí)花朵離水面高達(dá)3 cm，花被再次張開并反卷，雌蕊合攏，雄蕊高出雌蕊0.5 cm左右，呈輻射狀，花藥縱向開裂，大量散出淺黃色花粉。10:00以后花逐漸閉合沉入水中。第3天，花不再開放。

從莼菜短縮莖的不同節(jié)位上抽生分枝（水中莖），不同節(jié)位上的分枝第 1花芽著生節(jié)位是不同的。一般而言，第1分枝在第11節(jié)開始分化花芽，第2分枝則在第7節(jié)分化花芽，第3分枝在第5節(jié)分化花芽，每個(gè)短縮莖一般抽生5～6條水中莖。莼菜單條水中莖開花4～5朵，少數(shù)6朵，花著生葉腋部。各條水中莖單朵花開花間隔3～4 d，一般從下往上順序開放。現(xiàn)蕾到開花約需17 d，單朵花花期2 d。從受精完成到種子成熟需45 d左右。

2.2 莼菜的雜交指數(shù)（OCI）

根據(jù)調(diào)查結(jié)果，莼菜的花冠直徑超過6 mm，可以計(jì)為3；莼菜是雌蕊先成熟，應(yīng)計(jì)為0；柱頭與花藥之間空間分離明顯，應(yīng)計(jì)為1。因此，莼菜的雜交指數(shù)為4，根據(jù)Dafni（1992）的標(biāo)準(zhǔn)，莼菜的繁育系統(tǒng)為部分自交親和，異交。

2.3 花器官性狀的動(dòng)態(tài)觀察

從表1可知，第2天開放的花，其花柄出水高度、萼片長度、花瓣長度、雄蕊長度、花絲長度及花冠直徑都大于第1天開放的花，而萼片寬度、花瓣寬度、雌蕊長度和花藥長度均沒有變化。第1天雄蕊高度低于雌蕊，第2天雄蕊明顯高于雌蕊，花藥開裂利于傳粉。

表1 花器官數(shù)量性狀動(dòng)態(tài)觀察統(tǒng)計(jì)結(jié)果 cm

2.4 同一分枝不同節(jié)位花自然結(jié)實(shí)情況

由表2可知，第1朵花的花柄最長，其他部位花的花柄長度依次變短，花柄的長短與開花節(jié)位到水面的高度有關(guān)。第3朵花和第4朵結(jié)實(shí)心皮的比例較高，其他部位花結(jié)實(shí)心皮的比例較低，這可能是前期氣溫較低而后期氣溫又較高造成的。

表2 同一分枝不同節(jié)位花自然結(jié)實(shí)率

2.5 花粉生活力的動(dòng)態(tài)變化及花粉/胚珠（P/O）

由表3可知，花粉活力在散粉初期（1～3 h）無明顯變化，在第1天內(nèi)都保持83.5 %以上，到第2～3天開始慢慢下降，第4～5天后明顯下降，第10天后為0，完全失去活力。

每朵花的花粉數(shù)為239700～296000粒，而每朵花的胚珠數(shù)為 14～22個(gè)，莼菜花的 P/O值平均為14947，依據(jù)Cruden（1977）的劃分標(biāo)準(zhǔn)確定莼菜的繁育系統(tǒng)為專性異交。

表3 同一朵花散粉后不同時(shí)間的花粉活力變化

2.6 莼菜花的人工授粉

由表4可知，莼菜花去雄套袋和不去雄套袋兩個(gè)處理，結(jié)實(shí)率均為 0，表明莼菜花不存在無融合生殖現(xiàn)象，而自然授粉結(jié)實(shí)的花朵比例為72.3 %，結(jié)實(shí)心皮的比例為20.9 %，表明莼菜為異花授粉作物。

人工授粉（第1天開放的花）結(jié)實(shí)的花朵比例為95.2 %；結(jié)實(shí)心皮的比例為27.8 %，均高于自然授粉，其中結(jié)2粒種子的心皮所占比例為2.0 %，結(jié)1粒種子的心皮所占比例為25.8 %；胚珠發(fā)育成種子的比例為14.8 %。去雄不套袋結(jié)實(shí)的花朵比例為70.0 %，結(jié)實(shí)心皮的比例為14.5 %，略低于自然授粉的情況。

表4 莼菜花不同授粉處理的結(jié)實(shí)率

第2天開放的花人工授粉結(jié)實(shí)的花朵比例僅為18.2 %，結(jié)實(shí)心皮的比例為1.7 %，較第1天開放的花授粉結(jié)實(shí)率降低了很多，表明莼菜花柱頭的可授期主要在第1天，第2天的花柱頭可授性大大降低。

2.7 莼菜雜交技術(shù)

① 套袋。套袋時(shí)應(yīng)保證父本套袋的花較母本套袋的花提前一天開放。一般應(yīng)選取生長飽滿的花蕾，大小為9 mm×6 mm左右。套袋時(shí)用0.05 mm厚的硫酸紙袋，大小為10 cm×8 cm。② 采粉。對(duì)已套袋的父本花，取開放第2天（花粉剛剛散開）的花粉，裝入圓形帶蓋的鋁盒中備用。③ 去雄授粉。選取母本中套袋第 1天開放的花，先用鑷子去除雄蕊，然后用毛筆將已采的父本花粉散到柱頭上，再用硫酸紙袋套住，以防其他花粉污染柱頭。④ 去套袋。授粉3 d后，應(yīng)除去所套硫酸紙袋，同時(shí)將花摁入水中。⑤ 種子采收。莼菜種子在授粉后50～55 d成熟，成熟種子為黃褐色，此時(shí)即可采收。采收后的種子應(yīng)浸泡水中。

3 討論

本試驗(yàn)使用 P/O、OCI兩個(gè)參數(shù)對(duì)莼菜的繁育系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)后的兩個(gè)參數(shù)結(jié)果一致，表明莼菜的繁育系統(tǒng)為專性異交型。莼菜開花第1天，雌蕊成熟，柱頭高出雄蕊，其上有細(xì)毛狀物，白色，利于接受花粉，柱頭具有可授性；第2天花藥才開裂散粉，在自然情況下，柱頭第2天是可授粉的（人工授粉結(jié)實(shí)心皮的比例為1.7 %），因此不能排除有自花授粉的情況發(fā)生，但人工套袋自交中沒有結(jié)實(shí)現(xiàn)象，也可能是套袋過程中紙袋被水浸濕，導(dǎo)致雄蕊不能正常散粉。

根據(jù)套袋結(jié)果顯示，去雄套袋的結(jié)實(shí)率為 0，說明莼菜沒有無融合生殖現(xiàn)象；自然授粉結(jié)實(shí)心皮的比例為20.9 %，低于人工異花授粉（第1天的柱頭）結(jié)實(shí)心皮的比例（27.8 %），這可能是莼菜主要依靠風(fēng)來傳粉，從而造成傳粉不足導(dǎo)致的。另外，去雄不套袋結(jié)實(shí)心皮的比例（14.5 %）低于自然授粉結(jié)實(shí)心皮的比例（20.9 %），這可能是去雄時(shí)對(duì)花造成了一定的傷害而導(dǎo)致的結(jié)果。

莼菜是我國的一種特色水生蔬菜，由于對(duì)水質(zhì)和環(huán)境要求較高，只能在特定的地區(qū)栽培，對(duì)其傳粉生物學(xué)和種子生物學(xué)缺乏研究，通過傳粉生物學(xué)和種子生物學(xué)的研究（種子生物學(xué)研究將另文介紹），對(duì)于莼菜的資源保護(hù)、種質(zhì)創(chuàng)新和雜交育種具有重要意義。

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